脱氧核糖核酸DNA分析方法

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是DNA和RNA研究中常用的技术,可用于分离、鉴定及纯化DNA和RNA片段。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA和RNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。它们在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。不同大小、不同形状和不同构象的DNA和RNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭结合,在紫外灯下可看到荧光条带。

Southern印迹技术

这种方法常用于检测DNA片段的分子量大小,分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。也可用于基因诊断,了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。在分析中,将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其他合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。

PCR技术

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外核酸扩增技术。它能将所要研究的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,易于观察和判断。PCR广泛用于基因检测、基因克隆、DNA突变检测和DNA序列分析。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成:

  1. 模板DNA的变性:模板DNA经加热至95℃左右后,使模板DNA双链解链成单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
  2. 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
  3. 引物的延伸:DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性——退火——延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”。每完成一个循环需2~4分钟.2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

实时荧光定量PCR技术(real time-PCR)

实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR循环的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。这项技术可用于对DNA、RNA样品定量和定性分析。除此之外我们还可以对PCR产物或样品进行定性分析:例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体,以区分非特异扩增;利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。实时荧光定量PCR技术中,目前最常用的是SYBR Green检测法和TaqMan探针检测法。

  1. SYBR Green检测法:SYBR Green Ⅰ是一种双链DNA结合染料。与双链DNA结合后,其荧光大大增强,从而用于PCR扩增产物的检测。SYBR Green Ⅰ的最大吸收波长约为497 nm,发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺人DNA双链后,发射荧光信号,而不掺人链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
  2. TaqMan探针检测法:TaqMan探针是一对带有报道荧光基团的引物。其5’端有标记报道荧光基团(R),3’端有标记淬灭基团(Q)的寡核苷酸。报道荧光基团(R)如FAM、TET、VIC。淬灭荧光基团为TAMRA(Q、6-羧基四甲基若丹明)。当探针单独存在时,R的荧光受到Q的淬灭不产生荧光。在PCR的退火期,探针与DNA模板发生特异性杂交。在Taq酶作用下DNA模板延伸,由于Taq DNA酶的5’及3’端外切酶活性的作用,探针5’端的R被切断,Q的淬灭作用消失而使荧光恢复,这时荧光探测系统便会检测到相应荧光信号。随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

酵母双杂交系统

酵母双杂交系统(yeast twohybrid system)检测方法的原理是:将编码某一蛋白X的DNA序列与酵母DNA结合域的编码序列融合形成一个杂交体,将编码另一蛋白Y的DNA序列与酵母DNA激活域的编码序列融合形成另一个杂交体,两个杂交体共同转染酵母细胞(此酵母细胞上游有DNA结合位点的报道基因)。若X和Y没有相互作用,则单独不能激活酵母报道基因的转录;若X和Y可相互作用,则形成一个有效的转录激活子,激活报道基因的转录。因此可通过检测酵母报道基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。这种方法主要用于:

  1. 已知蛋白之间相互作用的检测;
  2. 蛋白质的功能域研究:通过对其中某—个蛋白质作缺失或定点突变,再用此系统检测是否还存在相互作用,可阐明其功能域或关键氨基酸。

单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A,G,C,T)插入、缺失、转换等而引起的多态性。例如:某些人染色体上某个位置的碱基是A,而另一些人染色体的相同位置上的碱基则是G。

SNPs的检测方法由两部分组成,即区分SNPs特异位点的原理方法和数据的检测分析手段。SNPs特异位点的原理方法包括:

  1. 杂交方法:如等位基因特异核苷酸片段杂交(ASO)、分子信标、动态等位基因特异杂交(DASH)、分子内标法等。
  2. 酶或PCR方法:如等位基因特异性PCR、双向等位基因特异性PCR、Taqman荧光探针法、引物延伸法、连接酶连接反应、连接一滚环扩增反应、RFLP等。
  3. 以构象为基础的方法:如单链构象多态性SSCP分析、温度梯度凝胶电泳TGGE、变性高效液相色谱技术DHPLC等。
  4. 质谱检测技术:如基质辅助激光吸附电离飞行时间质谱分析(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass specuometry,MALDI-TOF)等。
  5. DNA测序。

限制性片段长度多态性技术(restriction fragment length polymorphism,RFIP)

由于DNA的多态性,致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变,用限制酶切割基因组时,所产生的片段数目和每个片段的长度就不同,即所谓的限制性片段长度多态性(RFIP)。导致限制片段长度发生改变的酶切位点,又称为多态性位点。用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断,如果存在SNP位点,酶切片断的长度和数量则会出现差异,根据电泳的结果就可以判断是否有SNP位点以及出现的碱基替换的类型。该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点,它是SNPs筛查中最经典的方法之一。

基因克隆技术

基因克隆技术指在体外将DNA分子片段与载体(vectors)DNA片段连接,转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。基因克隆技术是现代生物技术的关键技术,也是皮肤病学研究中的重要技术。其基本步骤包括:制备目的基因叶将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接,制成DNA重组→导人宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体在细胞内自我复制,并使重组的分子片段共同增殖,从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,以深入分析基因的结构与功能。

基因序列测定技术

基因序列测定技术是根据Sanger等提出的酶法及Maxam和Gilbert提出的化学降解法,广泛用于基因克隆、SNP检测及基因突变分析。传统的手工测定方法耗时低效,已被高效而快速的基因自动化测序所替代。它采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,使用四色荧光染料标记的ddNTP以标记终止物。通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物是相差1个碱基的3’末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物。4种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,避免泳道间迁移率差异的影响以提高测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(chargecoupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等形式输出。

基因芯片

基因芯片(gene chip)又称为DNA微阵列(DNA microarray)。基因芯片的测序原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的8个核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列如TATGCAATCTAG.与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针位置,获得一组序列完全互补的探针序列,据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片通常用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究。例如用PCR法从皮肤细胞cDNA文库中得到上百种cDNA片段,制成芯片,用这种方法可寻找在正常皮肤组织和烧伤组织中表达有差异的基因。

基因芯片的检测方法,包括下列四个步骤:

  1. 探针的设计、合成与芯片的制作(商品化产品);
  2. 靶基因的制备:RT-PCR(设实验组和对照组)分别进行荧光素标记,如Cy3和Cy5;
  3. 生化杂交反应;与常规的分子杂交过程基本相似;
  4. 杂交信号的检测与结果的分析:激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号,计算机分析。

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