淋球菌的基因分型

染色体DNA限制性片段长度多态性分型

染色体DNA限制性片段长度多态性分型(Restriction Fragment length Polymorphism, RFLP)。不同淋球菌菌株的染色体DNA序列的限制性内切酶(Restriction Endonuclease,RE)切割位点不同,用相同的酶切得到大小不同的DNA片段,经凝胶电泳后形成不同的电泳谱型。每个RE型的电泳结果显示40至45条带,琼脂糖凝胶电泳能够很好地分辨2~21.5kb大小的DNA片段,脉冲场电泳只对2kb以下的片段有很好的分辨力。Falk等人用HindⅢ对10株WⅠ群淋球菌的DNA进行酶切,经脉冲场电泳后分成8个RE型,10株WⅠ、WⅢ群分成7个RE型。Pohl等人用HinfⅠ和BglⅡ分别酶切26株淋球菌后发现从每对性伴分离到的菌株或同一个人不同部位分离到的菌株其RE型均相同。RE型和血清型没有明显的关联,同一血清型的菌株具有不同的RE型,相同RE型可能有不同的血清型。RE分型简单、快速、分型能力强,但产生的条带过多,甚至有重叠现象。此外,质粒DNA也会影响谱型。因此现在RE分型较少采用。

染色体DNA脉冲场凝胶电泳分型:脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型是PFGE技术与限制酶分析相结合的一种方法。它常采用低频切割的限制酶(如SpeI和NheI)消化细菌DNA,产生少量20~500 kb的大片段DNA,再用脉冲电泳分离,不同的菌株可得到不同的带谱;而常规凝胶电泳不能分离大片段DNA(>50 kb)。Poh等人利用PFGE将属于18个A/S类的48株淋球菌分为38个SpeI和40个NheI限制酶谱型,显示出比A/S分类更高分辨力,适合于A/S的亚分型以及A/S不能分类细菌的分型。其分辨力高,结果稳定可靠,但需特殊仪器,而且费时。

随机扩增多态性DNA分型

随机扩增多态性DNA (RandomlY Arnplified Polymorphic DNA,RAPD),是美国学者Williams和Welsh于1990年首先提出的,该技术是通过分析DNA的PCR产物的多态性来推测生物体内基因排布与外在性状表现规律的技术。RAPD技术是以8~lO bp的随机寡核苷酸片段作为引物,以基因组为模板进行PCR扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或脉冲场电泳检测,研究DNA的多态性。由于随机引物在较低的复性温度下能与基因组DNA非特异性的结合,当相邻两个引物间的DNA小于2000 bp时,就能够得到扩增产物。与RFLP相比,RAPD具有很多优点。

  1. 事先不需要了解待测基因组的序列信息,只需很少纯度不高的模板,就可以检测出大量的信息;
  2. PCR时应用随机引物;
  3. 操作简便,不需要分子杂交、放射自显影等技术;
  4. 不受环境、发育、数量性状遗传等的影响,能够客观地提示供试材料之间DNA的差异。可以检测出RFLP标记不能检测的重复顺序区。

已有的研究表明:从性伴侣中分离的淋球菌具有相同的AFLP型别,从不同年份和不同地区分离的无关菌株具有不同的AFLP型别。AFLP分型的分辨能力明显高于A/S分类法,与opa分型的分辨能力相当。Palmer等应用AFLP将52株(含17株A/S型)淋球菌分为39个型,流行病学相关的菌株其APLP型别相同,无关菌株则不同。因此在传染源追踪方面具有重要意义。

OPA基因分型

淋球菌有11个高度变化的opa(外膜蛋白Ⅱ)基因家族。由于opa基因的组成成分广泛变异和迅速演化,因此opa分型为淋球菌短期传播的研究提供了一种高分辨的分型方法。PCR扩增不同菌株的11个opa基因,产物用限制内切酶消化,可显示出不同的opa基因谱型。O'Rourke等人分析了世界各地过去30年的淋球菌,opa型都不相同。新近从性病门诊分离到的41株淋球菌,除2对性伴的菌株具有相同opa型外,其他菌株opa型都不同。这些结果揭示了opa基因变昴的迅速程度。opa型别一致的淋病患者往往是性伴或短链传播的成员。建立在PCR基础上的opa分型法能利用尿道分泌物中的淋球菌DNA为模板,与分离培养物中的淋球菌DNA为模板的opa谱型比较,以区别感染者是否为混合淋球菌感染。一般情况下,生物表型和遗传性状非常接近的AHU-/ⅠA-2菌株用其他方法难以亚分,但用opa分型很容易区分。因此opa分型作为一种高效分型方法,对淋病流行病学和opa基因家族演变研究十分有用。

质粒图谱分析和质粒指纹图

质粒图谱分析是最早出现且最简单的核酸分析技术,其原理是基于相同淋球菌菌株含有相同大小和数量的质粒,通过对提取到的质粒在琼脂糖凝胶中进行数量和大小的检测,从而将不同质粒特征的菌株加以区分。在淋球菌中有3种类型的质粒:隐蔽性质粒、结合性质粒和耐药性质粒。耐药性质粒作为流行病学特征在追踪淋球菌对抗生素质粒耐药的传播中具重要性,如携带编码内酰胺酶质粒的淋球菌对青霉素耐药。但是质粒可以通过接合、转化或转导在同种和异种细菌间转移。此外,细菌在多次传代或保存过程中可发生质粒的丢失或消除,因此,质粒图谱更多的是反映某一质粒的流行,而不是某一菌株的流行。

核糖体基因分型

细菌染色体经限制酶消化后,将消化片段转移到尼龙膜上,以细菌序列探针进行杂交,根据杂交条带的数目和大小鉴别不同的菌株,这就是核糖体基因分型。核糖体基因分型的重复性较好,分型能力优于血清学分型、多位点酶电泳,但不及PFGE分型,可作为血清分型的一种补充方法。应用核糖体基因分型对不同来源淋球菌分型的研究表明,核糖体基因型与血清型无关联,不同血清型的菌株可有相同的核糖体基因型,属相同血清型的菌株可产生不同的核糖体基因型。

基于PCR的其他分型方法

扩增rRNA基因限制性分析(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis,ARDRA)是核糖体分型的一种方法。该方法是扩增核糖体基因的部分片段,包括16S rRNA基因的一部分,16S~23S rRNA基因间隔区的,23S rRNA基因的一部分,PCR扩增后使用高频限制性核酸内切酶进行PCR产物的消化,最后进行凝胶电泳分析9其他基于PCR的分析包括(荧光)扩增片段长度多态性(AFLP),全细胞重复元件序列为基础的PCR(REP-PCR)分析,随机引物的PCR(AP-PCR)或随机扩增多态性DNA (RAPD)分型,和多位可变数目串联重复序列(VNTR)分析(MLVA)。这些方法都没有得到广泛的使用,其缺点包括辨识度不高(AFLP和MLVA)、操作繁琐。

基于基因序列的分型方法

PorB基因序列分型:PorB的DNA序列分型方法是基于在一个扩展长度PorB的片段,它包括最多态链段,或该基因的全长的DNA序列分析(接近1000 bp)。PorB是血清型测定的抗原性靶标的编码基因,PorB的DNA测序,已经越来越多地单独或与其他基因组合使用,用于淋病奈瑟氏球菌菌株的DNA序列分型。遗憾的是,开发一个和血清型检测结果相一致的基因分型系统前景十分有限,因为影响PorB的精确氨基酸残基与单克隆抗体间的反应性的关键因素仍然是未知。这是由于PorB的广泛异质性、线性表位和构象表位,以及血清型测定的固有限制所导致的。

全长或延长PorB测序分型方法具有高辨识度和可重复性,所有菌株都能分型,所有基于DNA序列的结果能客观地在实验室之间进行比较。事实上,一个使用有限的PorB DNA序列(490 bp)上的分型序列数据库已经建立起来,使得国际间的分型序列序号得以比较。新开发的DNA自动测序技术已经降低了成本和扩大了全球范围内测序技术的普遍性。PorB序列分型方法已被用来描述同一区域的淋菌性种群,并确定菌株种类,追溯有亲源关系的菌群之间的联系。PorB测序也可用于补充其他分型方法,包括DNA序列为基础的方法,从而增加区分菌群的能力要求。

然而目前缺乏基于PorB序列分型的国际标准方法和相应PorB序列的数据库。如果能够建立基于PorB序列的国际数据库,并与NG-MAST数据库的建立相联系,将有利于实验室间的比对。其他PorB分型方法包括焦磷酸测序分型和应用生物素标记的探针检测的分型。焦磷酸测序分析涉及PorB的实时PCR扩增,随后通过焦磷酸测序分析PorB高度多态性片段。应用生物素标记的探针检测方法是基于生物素化的探针来PorB的可变区杂交。这些方法并没有被广泛使用,部分原因是缺乏相应的仪器设备。

多抗原位点序列分型

淋球菌多抗原位点序列分型(NG-MAST)方法检查的是淋球菌的两个高度多态性位点的可变内部片段:分别编码B亚单位结合蛋白的PorB (490 bp)和TBPB(390 bp检查)。NG-MAST,因具有高的鉴别能力和高再现性、分型能力,已被广泛使用,因为它很容易操作,可用于分析离散的等位基因数目。由于DNA测序的成本不断降低,这种方法对于资源有限的参考实验室更加适用。此外,菌株具有相同的NG-MAST的ST可进一步分化,通过使用附加的分型方法,如全长或延长长度PorB测序,PFGE或OPA分型。

NG-MAST已被应用于多个方面:用于定义淋球菌群和识别集群感染和特殊菌株,用于跟踪性接触,调奄治疗失败,法医案件等。NG-MAST也被评价为预测特定抗生素耐药表型的淋球菌菌株的工具,然而这种方法的应用不是很理想。更多的用以确定一定的ST是否是相关的特定的抗生素抗性表型和它们的时间稳定性的研究是必要的,这需要更多的表型,遗传,地理,和时间上不同的菌株。NG-MAST最常用于培养的标本,并且该方法可为使用所有类型的核酸检测试样进行优化。

多位点序列分型(MLST)

多位点序列分型是最早为了区分脑膜炎奈瑟菌菌株而制定并实施开发的分子流行病学和应变种群的遗传分析的一种方法。该方法是多位点酶电泳的分子延伸,对其中管家酶的电泳迁移率在淀粉凝胶上进行分析。MLST是对等位基因的内部片段的DNA序列中相对保守的七个或更多个染色体管家基因进行的分析。MLST分析中,每个基因座不同的序列都被分配了不同等位基因编码,等位基因中的七个位点的组合限定了一个等位基因分布。MLST能明确不用种型间的基因序列特征。菌种间的基因相关性可以通过他们等位基因之前的成对差异的矩阵构成的基因树状图来表示。相比其他分型方法,MLST在大多数微生物的分型方面具有很多重要的优点。MLST在基因检测的选择和数量上建立了一种更适当的,更高分辨率的方法。因此,这种方法适合于流行病学和人口生物学研究。MLST分析中菌株种型的信息能通过网络数据库来描述和存储。MLST方法也有其局限性,比如相比于其他微生物,还未被广泛应用于奈瑟菌的种群特征描述。例如,根据MLST分析,伤寒沙门菌,结核分枝杆菌和鼠疫耶尔森氏菌已被判定为具有克隆群结构。

近年来,已有数篇应用MLST对淋球菌进行基因分型的研究。在这些研究中,均是通过测定淋球菌的7个管家基因(fumC,gdh,glaA,gnd,pilA,pyrD,serC)序列,然后与参考株的管家基因序列进行比对。不论是从研究方法上,还是从对结果的最终解释上,与NG-MAST方法相比,MLST分型方法具有许多优越性。如Vidovlic等人应用MLST对加拿大2005年至2008年间分离到的淋球菌进行分析时发现,加拿大地区流行的淋球菌包括三个主要的流行株,相同的MLST型在耐药性方面更为相似。这些研究结果在公共卫生实践中具有重要的指导意义。

其他分型方法

若干其他分子分型方法已被用于淋球菌菌株分型。值得注意的是,MLEE (MLST的“始祖”)标明在多个染色体编码的管家酶等位基因变异。这种方法指示了菌株和克隆器之间的相关性。如果克隆群正被研究,MLEE的鉴别能力极低,在菌群生长和酶生产方面的解释十分费力。MLEE方法在研究细菌种类方面已经在很大程度上被换成MLST方法。

膜分型是利用编码外膜蛋白的五氨基酸序列(AAWAP)在数量和序列上的不同进行特征表述。通过PCR扩增外膜基因,随后根据PCR产物的大小分离,则能预测重复编码序列的数目。使用相同数量的外膜亚型模式复制进行DNA序列分析来进一步地对奈瑟菌株区分。这种方法已被用于暴发喹诺酬抗性的奈瑟菌分型,并与其他分型方法结合用于法医评价表征淋病奈瑟球菌菌株。该方法的区分能力有待评估。因为外膜单位是高度保守的致病奈瑟球菌属特有,它可能无法从其他奈瑟球菌属临床标本中区分淋球菌。

定制寡核苷酸微阵列分析淋病奈瑟菌的全基因组的方法很少被使用。然而从研究意义上来说,这种方法对于区分奈瑟菌菌种的基因序列,或者鉴别相近的奈瑟菌属和淋球菌属有着极高的能力。由于这种方法十分昂贵,需要复杂的设备和专业技术的解释,需要用PCR和/或理想的特异位点DNA测序证实结果,所以它们仍然是一个研究工具。

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