核酸扩增的7种方法

普通聚合酶链反应(PCR)

靶DNA分子变性后解链,两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合,在4种dNTP存在和合适的条件下,由DNA聚合酶催化引物由5'到3'扩增延长,每经过变性、复性、延伸一个循环,模板DNA增加1倍,新合成的DNA链又可作为下一个循环的模板,经过30-50个循环,可使原DNA量增加几百万倍。PCR具备特异、敏感等许多优点。

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法,主要由高温变性聚合酶链反应、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温(95℃)下,待扩增的靶DM~双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃):下,以引物3'端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5'→3'方向延伸,合成DNA新链(因其反应过程有高温,所以反应所用的聚合酶必须为热稳定DNA聚合酶)。这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。

引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的,两引物之间的序列未必清楚,这两段已知序列一般为15~20个碱基,可以用DNA合成仪合成与其对应互补的两条引物。除此之外,引物设计一般遵循的原则包括:

一、引物长度根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的几率为1次。因此,引物长度一般最低不少于16个核苷酸,而最高不超过30个核苷酸,最佳长度为20~24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度(通常72℃)下不会形成稳定的杂合体。有时可在5'端添加不与模板互补的序列,如限制性酶切位点或启动因子等,以完成基因克隆和其他特殊需要;引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。有时引物不起作用,理由不明,可移动位置来解决。

二、GC含量引物的组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体刮两个引物中GC百分比含量应尽量相似,在已知扩增片段GC百分比含量宜接近于待扩增片段,一般以40%~60%为佳。

三、引物内部应避免形成明显的次级结构,尤其是形成发夹结构。

四、引物之间不应发生互补,特别是在引物3'端,即使无法避免,其3'端互补碱基也不应大于2个碱基,否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”(Primer dimer)。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下,一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段,是PCR常见的副产品,有时甚至成为主要产物。

另外,两条引物之间避免有同源序列,尤其连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段,否则两条引物会相互竞争模板的同一位点。同样,引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其他序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则,引物就会与其他位点结合,使特异扩增减少,非特异扩增增加。

五、引物3'端配对DNA聚合酶是在引物3'端添加单核苷酸,所以,引物3'端5~6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格,这样才能保证PCR有效扩增。

引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定。

人工合成的寡核苷酸引物最好经过色谱(层析)纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长。一般情况下,不用的引物应保存在-20℃冰箱中,在液体中引物能保存6个月,冻干后可保存1~2年。

连接酶链反应(LCR)

LCR由基因扩增技术和连接酶方法结合而成,是继PCR之后的快速DNA扩增方法。与PCR不同的是,LCR采用2对寡核苷酸探针,每对寡核苷酸探针与变性正负靶链杂交时处于相邻的位置,两者之间形成一个缺口,只有当它们与靶DNA碱基配对且3'与5'端相邻位置均正确时,DNA连接酶才能将其连接起来。一旦2个探针相连接,连接产物可在下一轮循环中充当模板,通过变性与连接的重复循环,靶DNA链片段呈指数扩增。扩增后应用微粒子酶免疫技术(MEIA)对扩增产物进行测定,进一步提高了检测的敏感性和特异性。

LCR技术具有相当高的敏感性和特异性,其敏感性与PCR相同,由于LCR扩增的产物是正确退火并连接的寡核苷酸探针,所以其特异性高于PCR,且具有无创伤性采样、操作简单、分析时间短、无污染性、测定结果准确等特点。

链置换扩增技术(SDA)

SDA是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术,采用标记的两种不同荧光基团的探针。在SDA过程中,该探针被掺入到双链扩增产物中,由限制内切酶的酶切使淬灭基团与荧光基团分开,从而释放荧光,用荧光偏振检测法定量检测。SDA较之PCR有更高的扩增效率,耗时仅30min。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTPs以及钙、镁离子和缓冲系统。基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。

SDA技术同样具有较高的敏感性和特异性,但由于扩增时间和模板DNA浓度的影响可能会出现非特异性扩增产物的累积,因此需要利用热稳定机制优化其扩增条件。

转录介导的扩增技术(TMA)

TMA是一种利用RNA聚合酶和逆转录酶在约42℃等温条件下来扩增RNA或DNA的技术,其原理是带有T7 RNA聚合酶识别的启动子序列的启动子引物与模板退火经反转录形成RNA-DNA杂交分子,被反转录酶的RNase H活性水解形成单链RNA,然后与引物2退火,通过反转录合成双链DNA,在T7 RNA聚合酶的作用下转录,由一分子DNA模板可得到100~1 000拷贝转录本,在15~30 min内可将靶序列扩增1010左右,由此可对核酸进行检测和定量。

TMA是比较敏感的核酸扩增技术,其检测比较简便,适合高通最筛选,已有商品化的沙眼衣原体和淋球菌的双检试剂,具有较高的敏感性和特异性。

实时荧光PCR

实时荧光PCR,即在常规PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。实时荧光PCR是目前使用最多的核酸检测方法。

实时荧光PCR技术采用完全闭管荧光检测,无需电泳,有效地解决了常规PCR的污染问题,还可以定量检测标本中的病原体,并且操作更简便、快速,有很高的临床实用价值。但试剂和仪器设备都比较昂贵,临床上应根据患者需要加以选择应用。

引物设计要尽量满足以下要求:

  1. 避免重复碱基,尤其是G。
  2. 引物退火温度Tm控制在58~60℃。
  3. G+C为30%~80%。
  4. 3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。
  5. 正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。
  6. 扩增产物长度不能太大,一般在80~250 bp,80~150bp最为合适。
  7. 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应跨内含子,这样可以更有效地不受基因组DNA污染的影响。

  TaqMan探针设计的基本原则:

  1. TaqMan探针位置尽可能靠近扩增引物,但不能与引物重叠。
  2. 长度一般为18~40碱基。
  3. G+C含量控制在40%~80%左右。
  4. 避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。
  5. 在引物的5'端避免使用G。
  6. 选用比较多的碱基C。
  7. 退火温度Tm控制在68~700C左右。

多重PCR

多重PCR是在单一PCR基础上改进和发展起来的新技术,是在同一PCR体系中加入多对特异性引物,一次扩增多个DNA片断,实现多个基因序列或多种病原体的同时检出。多重PCR降低了检测成本,减少了工作量,提高了检测效率,并且可以解决淋球菌、衣原体等混合感染者临床症状不明显,检出率低等问题。淋病患者往往患有其他性传播疾病,因此多重PCR在淋病的检测中有良好的应用前景。

环介导的等温扩增法

2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Research(核酸研究)杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术,即环介导等温扩增技术,英文名称为“Loop-mediated isothermal amplification",受到了世卫组织、各国学者和相关政府部门的关注,短短几年,该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中。通过推广,环介导等温扩增技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中,并得到了欧美国家的认同。该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外,操作十分简单,对仪器设备要求低,一台水浴锅或恒温箱就能实现反应,结果的检测也很简单,不需要像PCR那样进行凝胶电泳,环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断,简便快捷,适合基层快速诊断。

环介导等温扩增方法优点:灵敏度高(比传统的PCR方法高2~5个数量级);反应时间短(30~60 min就能完成反应);临床使用不需要特殊的仪器;操作简单(不论是DNA还是RNA,检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于反应管中,置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30~60 min,肉眼观察结果)。

环介导等温扩增方法缺点:灵敏度高,÷旦开盖容易形成气溶胶污染,力Ⅱ上目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重。引物设计要求比较高,有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。

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