淋球菌核酸扩试验:核酸提取

核酸扩增试验(Nucleic Acid Amplification Test,NAAT)是通过扩增淋球菌的特异性基因来检测病原体,方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增技术(SDA)、转录介导扩增技术(TMA)、实时荧光PCR和多重PCR等。

淋球菌基因组DNA的提取方法

热裂解法:在无菌条件下,取1.5 mL离心管,加入ddH2O(双蒸水),从TM培养基上挑取单克隆淋球菌落,充分混匀,于100℃热裂解5 min,冰浴中冷却5 min,重复操作一次后,在室温下,12 000 rpm离心5min,取上清,-20℃保存。

白酶K裂解法:取1.5mL离心管加入裂解液(NP-40、Tween 20),在无菌条件下用接种环挑取单克隆淋球菌,混匀;分别加入EDTA、终浓度为1%的SDS、蛋白酶K至50 μg/μL后,50℃ 1h,消化后12 000 rpm高速离心10 min,取上清;在上清中加入等体积的酚(去蛋白质),混匀,12 000 rpm离心10 min,取上清,如蛋白质较多,可重复此步;上清中加入等体积的氯仿,混匀,以5 000 rpm高速离心lO min;取上清,加入2.5倍体积95%乙醇沉淀,冷冻干燥后,用TE溶解,于-20℃冰箱保存。

用万用裂解液裂解细菌:取一接种环细菌,于1.5 mL的离心管中,加入万用裂解液,进行混匀,60℃保温1~2h,每隔20 min混匀一次,直到用移液枪吸取时基本不拉丝为止,吸取3~5mL做PCR。

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法:取1.5 mL离心管加入TE缓冲液,在无菌条件下用接种环挑取单克隆淋球菌,混匀,加入1O%的SDS及20 mg/L的蛋白酶K于37℃温育1h。加入5 mol/LNaC1和CTAB/NaC1溶液,混匀,于65℃温育10 min。标准酚-氯仿-异戊醇抽提,将上清液转入一只新管中。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA,离心,去异丙醇后用于乙醇洗涤,TE溶解模板,-20℃保存。

生殖道拭子样本的采集及处理

采集:采集生殖道拭子标本,要求病人在采样前2h内不能排尿。采样时,将棉拭子伸入男性尿道及女性宫颈口2~3 cm,转动一周以获得上皮细胞。将取样后的棉拭子放入1.0 mL无菌生理盐水中漂洗片刻,在管壁上挤干后丢弃。

存放及运输:标本保存在-20℃,要求在十天内处理完毕,或将标本保存于-70℃,保存期半年,避免反复冻融。用冰壶加冰或泡沫加冰密封进行运输。

标本处理

  1. 将样本置室温解冻后,振荡混匀。
  2. 13 000 rpm离心10 min,倒去上清,将标本倒置于吸水纸上,吸干管口的液体。
  3. 加入1 mL灭菌的0.9%NaCl溶液(或注射用生理盐水),振荡悬浮。
  4. 重复步骤(2)
  5. 加队DNA提取液50 pL,振荡涡匀后,置100℃水浴/干浴10 min
  6. 12000 rpm离心10 min,保留上清待用(如已裂解的标本当天不使用,请于-20℃保存)。

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