淋球菌的分离培养与鉴定

如果标本中有淋球菌,则在合适的培养基上及合适的环境下经培养后可长成菌落。各种细菌的菌落形态各不相同,可根据菌落的大小、表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等,作为细菌鉴定的标准。得到纯菌后还可进行其他试验,比如分离的单个菌落经纯培养后可以进一步进行鉴定。

检测准备

仪器耗材:

  1. 一次性无菌采集拭子(分男女专用)、乳胶手套、床单等。
  2. 妇科检查床及扩阴器。
  3. 烛缸培养箱或C02培养箱。
  4. Thayer-Martin( TM)培养基或其他培养基。
  5. 革兰染液。
  6. 普通显微镜及香柏油。
  7. 氧化酶试剂。
  8. 糖发酵试剂。
  9. 其他可能用到的仪器耗材。.

标本采集:见本栏目第一篇中标本的采集部分。

分离培养

培养基

由于淋球菌的营养要求较复杂,所用的培养基中应含有动物蛋白及细菌生长所需的各种因子,所以分离淋球菌一般选用营养丰富的选择性培养基。为抑制杂茵,在培养基中可加入适量抗菌物质。培养基的pH值以7.4为好。目前常用的培养基有Thayer-Martin(TM)培养基、改良MTM培养基、New York City (NYC)培养基、Martin-Lewis(ML)培养基、血液琼脂或巧克力琼脂培养基等。TM培养基是在GC基础培养基中,加入血红蛋白(l%)、抗生素(万古霉素3 μg/mL、黏菌素7.5 μg/ml和制霉菌素12.5 μg/mL)和淋球菌增菌剂,使绝大多数杂菌被抑制而淋球菌菌落长得较大,在平皿中几乎呈纯培养,从而大大提高了由宫颈、尿道,尤其是咽和直肠部位分离出淋球菌的阳性率。可购买商品化的培养基或实验室自配,培养基应密封在塑料袋中,于40C冰箱保存,保存时间不应超过3周,时间过久会降低淋球菌的分离率。

Thayer-Martin(TM)培养基配制法

一、成分:

  1. GC基础培养基:将蛋白胨1.5g、玉米粉0.1g、磷酸氢二钾( K2HP04) 0.4g、磷酸二氢钾(KH2P04) 0.1g、氯化钠(NaCl) 0.5 g和琼脂1.2 g混合而成。
  2. VCN抑菌剂:1 mL溶液中含万古霉素300μg、多黏菌素E 750 μg和制霉菌素1 250单位。为抑制变形菌可加三甲氧苄氨嘧啶500 μg。配成后应立即用完或贮于-20℃以下于2周内用完。
  3. Iso-Vitalex增菌剂:每升蒸馏水中加入维生素B 120.01g、L-谷酰胺10.0g、P-氨基苯甲酸0.012g、腺嘌呤1.0g、鸟嘌呤0.03g、二磷酸吡啶核苷酸0.25g、硫胺焦磷酸0.1g、硝酸铁0.02g、硫胺0.003g、L-半胱氨酸25.9g、L-胱氨酸1.1 g和葡萄糖100 g。
  4. 2%血红蛋白溶液。

二、配制方法:

  1. 制备双倍浓度的基础培养基:将GC基础培养基7.2 g溶于100 mL蒸馏水中(用500 mL烧瓶),充分混匀,边加热边搅动直至煮沸,使充分溶解,经高压灭菌后凉至50℃待用。
  2. 将2g血红蛋白粉放入研钵,加2~3 mL蒸馏水研成糊状,逐步加入蒸馏水直到100 mL,高压121℃ 20 min灭菌。
  3. 配制增菌剂:每安瓿增菌剂加入稀释液2 mL,使溶解。
  4. 配制抑菌剂:每安瓿抑菌剂加入蒸馏水2 mL,摇动,使充分溶解。
  5. 在无菌条件下将100 mLGC基础培养基、100 mL2%血红蛋白液、2 mL增菌剂和2 mL抑菌剂混合后倒入平皿。4℃冰箱保存、待用。

改良Stuart运送培养基配制法

琼脂4g、蒸馏水1 000 mL,加热到琼脂溶化并趁热加入氯化钠3g、氯化钾3 g、无水磷酸二氢钠0.15g、硫代乙醇钠1g、新配制的l%氯化钙溶液10 mL和l%氯化镁10 mL,pH7.3。

上述物质趁热搅动直到溶解。加入10 g中性炭末。分装于13 mm×100 mm试管(外径13 mm,长度100 mm),每管5~6mL。在121℃灭菌20 min,在琼脂末凝固前摇动小管,然后立即浸入冷水中使琼脂迅速凝固,要求使炭粒均匀分伟在培养基中而不是沉于管底。

接种标本

取材后标本应尽可能及早接种。培养基应先置于36℃预温。将取材的拭子转动涂布于平皿的上1/4范围,然后用接种环分区划线,以保证获得较纯的单个菌落。

培养条件

接种标本后,立即将平皿置于36℃、含5%~IO%CO。、湿润(70%湿度)的环境中培养。淋球菌为需氧菌,但初代分离需要C02。C02环境可由CO2培养箱、CO2产气袋或烛缸提供。使用烛缸时,应使用白色、无芳香味的无毒蜡烛。在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度。

注意事项

一、培养要获得成功,取材是关键之一。取材的深度一定要够,因为淋球菌好发于柱状上皮细胞而不是复层鳞状上皮细胞。男性尿道前端包括舟状窝都为复层鳞状上皮覆盖,所以要深入到尿道内2~3 cm处,以获取少量脱落的黏膜上皮细胞,阳性率才高。女性患者取材时,要求将棉拭子插入富颈管,转动并停留10~30 s也是这个道理。有些人只在阴道口取少量分泌物作分离培养,阳性率当然会降低,因为有活力的菌从宫颈随分泌物由阴道流出需一定时间,阴道内pH值低,又因各种杂菌的作用,到阴道口时淋球菌的活力降低,再加上培养过程中各种因素的影响,培养成功的机会就会减少。

二、对症状不典型的男性患者取材,最好是在晨起排尿前或排尿后2~3 h之后。另外,采样者应熟练掌握前列腺按摩术,必要时作前列腺按摩取材检查。

三、血液琼脂或巧克力琼脂中加入多黏菌素和万古霉素以分别抑制革兰阴性和革兰阳性杂菌,但由于部分淋球菌(某些地区可高达5%)对万古霉素也敏感,因此,最好不用万古霉索。

四、淋球菌在培养基上培养24h,虽能见到菌落,但较小,难以辨认其特点。24~48h,菌落迅速长大,所以观看菌落特征最好在36h左右。

临床意义

培养法有较高的敏感性和特异性,是世界卫生组织推荐的诊断淋病的“金标准”,对男性、女性、亚临床感染者以及疗效观察者的检测标本都具有较高的敏感性。

鉴定

淋球菌的鉴定分为初步鉴定与确证试验。菌落特征、氧化酶试验和革兰染色是初步鉴定淋球菌的三个主要依据。对于取自泌尿生殖道的标本,在选择性培养基上分离出氧化酶阳性的革兰阴性双球菌,一般可诊断为淋球菌,准确性可达98%。但对取自泌尿生殖道外部位的标本或涉及医疗法律案例的分离株,应对培养的菌株经糖发酵试验或直接免疫荧光试验等进一步鉴定、确证。

茵落特征

选择性培养基上分离出的淋球菌菌落大小及形态随培养基及培养时间的不同可略有差异。总体而言,淋球菌在培养基上经24~48 h的培养后,可形成圆形、细小、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落,边缘呈花瓣状,直径为0.5~1.0 mm,用接种环触之有黏性。如继续培养,菌落面积增大,直径可达3 mm,表面变得粗糙,边缘平滑或呈锯齿状。

氧化酶试验

淋球菌在生长过程中产生氧化酶。向培养基上生长了24。48 h的菌落上滴加氧化酶试剂(0.5%~1%新配制的盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺水溶液),淋球菌菌落的颜色可变成深紫红色(盐酸二甲基对苯二胺)或深紫蓝色(盐酸四甲基对苯二胺)。

一、方法

  1. 在混有杂菌的淋球菌分离平皿上滴加氧化酶试剂后变成深紫红色或深紫蓝色的菌落为氧化酶试验阳性。
  2. 也可先挑取可疑菌落涂于干滤纸条上,滴加试剂,涂菌处变色者为阳性
  3. 也可先滴一滴试剂于滤纸条上(勿太湿),再涂菌落,观察颜色变化。

二、结果:淋球菌氧化酶试验阳性。但氧化酶试验阳性者并不完全是淋球菌。某些细菌氧化酶反应性如下表所示:

氧化酶阳性菌(反应强弱程度)
 
氧化酶阴性菌
奈瑟菌属 Neissena(强) 大肠杆菌样菌 Coliform group
多数弧菌 Most vibrios(强) 沙门氏菌属 Salmonellae
布氏菌属 Brucellae(中) 棒状杆菌属 Corynebacteriae
炭疽和类炭疽杆菌 Anthrax and anthracoids(中) 链球菌 Streptococci
马鼻疽杆菌 Pseudobacterium mallei(中) 葡萄球菌 Staphylococci
绿脓杆菌 Pseudomonas Pyocyariea(中) 八叠球菌 Sarcinae
嗜血杆菌属 Haemophilus(中) 厌氧菌 Anaerobes

三、注意事项

  1. 为了保证良好的反应,所用氧化酶试剂不应过分陈旧。正常的氧化酶试剂应为淡红色。如果试剂买来时已成灰色或黑色,说明已失效而不应使用。试剂溶液配好后应放在棕色玻璃瓶中避光保存,可使用一周。
  2. 氧化酶试剂遇铁也会出现红色而造成假阳性,所以操作用的接种环应避免用旧铁丝或电炉丝等制成,并在每次试验前先检查是否未挑菌的接种环接触试剂就有红色出现。
  3. 如需保留菌种,在菌落未完全变黑时可挑少许转种。菌落一旦变黑,多数菌即告死亡。

四、临床意义:氧化酶试验试剂易得,操作简便,是淋球菌重要的初步鉴定试验之一。淋球菌氧化酶试验为阳性,但氧化酶反应并非特异性试验。所有奈瑟菌属细菌及许多其他细菌,包括多数弧菌、布氏菌属、绿脓杆菌及嗜血杆菌属等氧化酶反应亦呈阳性。如氧化酶阴性,一般可排除淋球菌。标本涂片茵体形态符合淋球菌特征,培养长出淋球菌样菌落,加上氧化酶试验阳性,即可做出初步诊断,开始治疗。如某些性状不符,则应进一步做确证试验。

革兰染色

取单个可疑菌落制备涂片作革兰染色,在显微镜下检查。24 h的新鲜菌落可见到呈典型肾形的革兰阴性双球菌(约占25%),其余75%为单球菌、四联形或八叠形。超过48h的较老培养物,因细胞自溶,革兰染色常难以说明问题。

糖发酵试验

用作糖发酵试验的培养基中除供给淋球菌生长所需的营养物质之外,还加有各种糖类和指示剂。淋球菌有分解葡萄糖的酶类,当它分解葡萄糖时产酸,使培养基的pH值降低,因而培养基中的指示剂颜色改变,如酚红由红变黄,溴甲酚紫由紫变黄。淋球菌仅分解葡萄糖,而不分解麦芽糖、乳糖及蔗糖,与其他奈瑟球菌均不同,故可以利用糖发酵试验加以鉴别。几种奈瑟菌的糖发酵反应情况如下表所示。

几种奈瑟菌的糖发酵反应情况
  葡萄糖 麦芽糖 乳糖 蔗糖
淋球菌 + - - -
脑膜炎球菌 + + - -
干燥球菌 + + - +
Ⅰ型黄色球菌 + + - +
Ⅱ型黄色球菌 + + - -
Ⅲ型黄色球菌 + + - -
黏液球菌 + + + +
卡他球菌 - - - -

一、仪器材料

  1. 水浴箱、~次性过滤灭菌器。
  2. 分析纯以上的葡萄糖、麦芽精、乳糖、蔗糖(配制成20%溶液,过滤灭菌)、缓冲平衡盐指示溶液(BSS)。BBS溶液配制:每1L中含磷酸氢二钾( K2HP04) 0.4g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1g、氯化钾(KCI) 8.0g、酚红0.6g、pH 7.1~7.2,过滤灭菌,存于4℃备用。
  3. 含1%生长添加剂的GC基础琼脂+2%血红蛋白培养基(或者含1%生长添加剂的GC基础培养基+10%新鲜脱纤维羊血)等。

二、方法:世界卫生组织( WHO)推荐的微量试管法。

  1. 分纯:取选择性培养基上疑似单个菌落,转种到含1%生长添加剂的GC基础琼脂+2%血红蛋白培养基中,纯培养16~18 h。
  2. 制备菌悬液:取纯培养菌2满环(直径3mm),混悬于0.4 mL的BSS溶液中制成高浓度的菌悬液。
  3. 制备糖管;取5支小试管,在1~4管中分别加入0.05 mL的20%葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖,第5管不加糖(对照管)。
  4. 加BBS溶液:每管加入0.1 mL BBS溶液。
  5. 加菌悬液:每管加入0.05 mL浓菌悬液,充分混匀。
  6. 孵育后观察结果:37℃水浴箱中孵育2~4h后观察结果。

三、结果判断:淋球菌仅发酵葡萄糖,产酸不产气,不发酵其他糖类。因此葡萄糖管的颜色由红色变为黄色,其他糖管颜色不变。

四、注意事项

  1. 试验所用糖纯度要高,应选用分析纯以上的糖。
  2. 待检菌株应使用培养16~18 h的纯培养细菌,即接种发酵管的菌要纯,不能用选择性培养基上的初代分离菌,如若混有杂菌,就会影响结果a如使用超过24 h的培养物,可能产生假阴性结果。
  3. 缓冲液pH值不合适或放在C02培养箱中培养,会使所有糖管均变黄。

五、临床意义:选择性培养基上分离出的氧化酶阳性、革兰阴性的双球菌,若糖发酵试验阳性可确定为淋球菌。糖发酵试验的特异性为99%~100%,某些淋球菌菌株尤其是AHU分离株反应弱,可呈现阴性葡萄糖反应,需用另外的试验加以鉴定。麦芽糖阴性的脑膜炎球菌也会被误鉴定为淋球菌,故对泌尿生殖道外的分离株最好采用一种以上的鉴定方法。

直接免疫荧光试验

将淋球菌抗血清(单克隆抗体)用荧光素标记,当遇到淋球菌(抗原)时,抗体与抗原结合,在荧光显微镜下可见到发苹果绿色荧光的菌体。

一、方法:将可疑菌(纯菌)制成菌悬液,取一环菌液放于载玻片的圆圈内。玻片置空气中干燥,加热固定。把荧光抗体试剂加于涂膜上,放于一湿盒中,置室温作用5分钟。用磷酸盐缓冲液轻轻淋冲,充分洗去未结合的抗体。再将涂片在空气中干燥后,于涂膜中央滴加一滴廿油封固液,盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察结果。同时涂一张涂片作革兰染色作为对照。

二、结果:在荧光显微镜下见到发苹果绿色荧光的双球菌为阳性。

三、注意事项

  1. 本法为直接免疫荧光抗体染色法,仅抗原抗体参加,方法简便、快速,死菌也可用作试验。但某些抗淋球菌荧光抗体也可与脑膜炎球菌及其他奈瑟菌起交叉反应。此外,也发现有少数淋球菌菌株不与所用抗体起反应。
  2. 加了荧光抗体试剂的涂片应放在湿盒内以防干燥,否则干燥的荧光抗体附在了玻片上会产生非特异性荧光,影响观察结果。
  3. 封固剂中甘油的纯度要高,低质甘油产生的自发荧光会影响结果的正确判断。

四、临床意义:选择性培养基上分离出的氧化酶阳性、革兰阴性的双球菌,若直接免疫荧光试验阳性可确定为淋球菌,但敏感性与特异性均低于糖发酵试验,应用较少。

结果报告

24—48 h培养后,具有典型的淋球菌菌落特征、革兰染色阴性及氧化酶试验阳性可报告为“初步鉴定有淋球菌生长”,如有糖发酵等确证试验阳性结果可以报告“确证培养有淋球菌生长”,培养48h还没有淋球菌特征菌落生长可报告“无淋球菌生长”。

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