淋球菌耐药的监测方法:抗菌药物敏感性试验

K-B纸片琼脂扩散法

原理:将含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散,形成递减的浓度梯度。在纸片周围可抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制,从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性。

抗菌药物纸片:专用药敏纸片,用加样或浸泡的方法使每片的药量达到一定的规定量,冷冻干燥后密封,-20℃保存备用。

培养基:水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH)琼脂是对生长较快的需氧和兼性厌氧菌进行药敏试验的标准培养基,pH 7.2~7.4,琼脂厚度为4 mm。对营养要求较高的细菌进行药敏试验时,应在MH琼脂中加入相应的营养添加剂。

细菌接种;接种物的准备可采用生长法或直接菌落悬液法。为使药敏试验的接种浓度标准化,应使用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度,制备好的菌液应在15 min内接种完毕。置35℃孵育16~18 h后读取结果,厌氧菌应在含CO2的环境中培养,葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h,以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。

结果解释和报告:用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径,参照NCCLS标准判断结果。常分为以下三级:

  1.  敏感(susceptible):表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后所达到的血药浓度所抑制或杀灭;
  2. 中介(intermediate):指测试菌对常规剂量用药后体液或组织中的药物浓度的反应性低于敏感株,但在测定药物浓集部位的体液(如尿液)或使用高于正常给药量(如β-内酰胺类)时临床上使用有效;
  3. 耐药( resistant);指测试菌不能被在体内感染部位能达到的抗菌药物浓度所抑制。

纸片法药敏结果的因素:培养基的质量对结果的准确性有直接影响,如pH、硬度、湿度和深度等:药敏纸片的含药量是影响抑菌圈大小的重要因素;接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一;试验操作质量;孵育条件和温度、时间;抑菌圈测量工具的精确度;质控菌株本身的药敏特性是否合格,有无变异。

质量控制:采用标准菌株是进行药敏试验质量控制的主要措施。常用的临床药敏质控标准菌株有:金黄色葡萄球菌ATCC25923,大肠杆菌ATCC25922,铜绿假单胞菌ATCC27853等。

稀释法

稀释法是定量测定抗菌药物抑制细菌生长作用的体外方法,分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。稀释法所测得的某抗菌药物能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)。

肉汤稀释法:常量稀释法(macrodilution)和微量稀释法(microdilution)。原理是用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释后,再接种待测菌,定量测定抗菌药物抑制或杀灭待测细菌的最低抑菌浓度或最低杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration MBC)。对于需氧菌、兼性厌氧菌推荐使用MH肉汤;而对于流感嗜血杆菌、链球菌则需在该培养液中加入补充营养成分。

琼脂稀释法:琼脂稀释法是将不同浓度抗菌药物分别混匀于琼脂培养基中,配制出含各种浓度药物的平板,使用微量多头接种仪接种细菌,孵育后观察细菌在含不同浓度药物的平板上的生长情况,以抑制细菌生长的平板所含的药物浓度测得最低抑菌浓度(MIC)。该法的特点是可同时做多株细菌的MIC测定,结果重复性优于肉汤稀释法,且易于发现耐药突变株或污染,是验证新药体外抗菌活性时常用的参照标准。

E试验

E试验是一种结合了稀释法和扩散法的原理和特点,测定微生物对抗茵药物的敏感度的定量技术。

E试验法足扩散法的一种变式,但它结合了扩散法和稀释法的特点,用非渗透性塑料条作为测试条的载体,测试条的一端至另一端包被着呈指数函数连续变化的抗生素药物,在测试条的背面根据抗生素药物浓度梯度标注经校准的MIC数值。将检测条贴于琼脂平板表面时,药物经扩散会形成一个连续变化的浓度梯度,经培养后平板上会根据待检菌株耐药性的差异形成大小不同的椭圆形抑菌圈,在抑菌圈与测试条的交界处所对应的数值即为该药物对菌株的MIC值。

E试验所运用的培养基以及菌株接种等操作与纸片法相似,简便灵活,可手工操作,对药敏结果可进行连续性定量判读,该方法在临床实验室还作为菌株非正常耐药和模糊结果的确认,并用于生长缓慢菌株的药敏测定。

联合药物敏感试验和杀菌试验

抗菌药物联合用药可以出现4种结果:

  1. 无关作用:两种药物联合作用的活性等于其单独活性;
  2. 拮抗作用:两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性;
  3. 累加作用:两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和;
  4. 协同作用:两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。

联合抑菌试验:棋盘稀释法是目前临床实验室常用的联合抑菌定量方法。计算部分抑茵浓度(Fractional Inhibitory Concentration,FIC)指数。判断标准:FIC指数<0.5为协同作用;0.5~1为相加作用;1~2为无关作用;>2为拮抗作用。

低杀菌浓度测定:MBC是指能杀灭99.9%以上测试菌量的最低药物浓度。测试的方法包括培养基、药物稀释、细菌悬液接种等,与MIC测定法相同。不同之处是:生长对照用MH肉汤以1:10稀释度连续4次稀释,35℃孵育过夜,计算菌落数。当MIC无肉眼可见菌,生长管中的菌落数≤最初接种菌落数的0.1%,该管的最低药物浓度即为MBC。

药敏自动检测系统

目前主要有3种被广泛采用的药敏自动检测系统,分别为MicroScan WalkAway系统、VITEK系统及BD Phoenix系统,它们都是基于肉汤微量稀释法原理设计以测定药物的MIC值。自动药敏检测系统一般都包括标准浓度细菌悬液的配制、接种、培养、菌株生长情况测定及报告MIC值5个步骤,但不同系统在细菌生长检测及MIC报告方面存在一定的差别。MicroScan WalkAway系统属于传统的过夜培养系统,运用标准肉汤微量稀释法。系统运用内含干燥培养基及抗生素药物的标准96孔板,细菌悬液的配制、接种需人工完成,然后置于设备内进行培养,运用分光光度法检测细菌生长情况,根据检测结果判定MIC值。VITEK系统自配有专门的测试卡,测试卡上含有64个微孔,孔内含培养基干粉和抗生素药物,人工完成待测菌悬液配置后系统可自动进行接种以水化测试卡内的培养基和抗生素,自动密封测试卡后置于系统内培养和细菌生长检测。

该系统可动态监测细菌生长情况,将生长速率与药物浓度作线性回归分析后判定MIC值。新型的VITEK2系统更为先进,可自动完成样品前处理。Phoenix系统是最近才被美国食品和药物管理局认可的一种药敏检测系统,专用测试条上有85个微孔,内含16~25种二倍梯度稀释的不同抗生素药物。人工完成待检菌悬液配置和接种后,置于系统内培养、生长检测、报告MIC值及进行结果分类。该系统对细菌生长的检测区别于以上两种系统,它通过添加刃天青作为氧化还原指示剂,通过检测还原态刃天青的荧光强度来判定菌体生长状况,判定药敏结果。

3种自动检测系统虽然在抗生素自主灵活选择上,在针对一些生长缓慢菌株、厌氧菌及厌氧菌的药敏检测上都存在一定的局限性,但鉴于它在药敏结果的数据报告、分析及传递方面的便捷性及准确性,已经逐渐替代传统CLSI标准方法,成为在临床实验室广泛运用的药敏检测方法。

新型药敏试验技术

流式细胞荧光法抗生素敏感试验

是一种利用流式细胞术进行细菌药敏检测的新技术,一般通过活体荧光染料标记微生物细胞以检测群体中的异质性细胞,从而判定药物对细菌个体生理功能状态的影响。该方法快速、灵敏,与之相比,传统的药敏试验(包括稀释法和扩散法)针对的是细菌群体检测,不能实现抗菌药物对细胞个体生物学性状及生理功能状态影响的定性和定量检测,而且耗时耗力。

根据使用的活体荧光素特性差别,流式细胞荧光法可分为两类。一类是检测死细胞或受损细胞群体,例如,碘化丙啶染料在细菌受药物作用导致细胞膜缺损后,能进入细菌细胞内嵌入核酸中,在激光的激发下可发出红色荧光;另一类是检测活性细胞群体,如二乙酸荧光素,它是一种无极性、无荧光酯,本身不发荧光,渗入活细胞后,可被胞质中的酯酶迅速水解释放出荧光素,在蓝光激发下呈黄绿色荧光,而死菌和被药物抑制的细菌因缺乏活性酯酶而不能有效地水解二乙酸荧光素,游离荧光素产生会相应减少,通过流式细胞仪检测荧光强度的变化来推断药敏试验结果。利用流式细胞荧光法一般不能直接得到药物对细菌的MIC值,它需要与传统的药敏试验方法进行比对,从而划定特定的阳性荧光信号率或平均荧光强度所对应的药物浓度为MIC值。

基于微流体技术的药敏试验

微流体技术通过构建微流体通道系统来实现各种复杂的微流体操纵功能,该技术作为生物芯片的一项关键支撑技术也得到了人们越来越多的关注。基于微流体技术的药敏试验是一项最新报道的快速药敏检测技术,可在2小时内实现药敏检测,可应用于临床现场、快速检测。试验是在一个可透气、透光的聚三甲基硅氧烷构建的微通道内进行,通道的深度一般在250μm以下,由于它具有很大的比面积值,因此能高效地保证氧气的溶解,好氧菌体在微通道内生长速率远远高于接种于96孔板及琼脂平板。首先,将不同浓度的药物与接种待测菌的培养基混合后注入微通道,同时设置对照组,利用相差显微镜可实时观测细菌生长状况,培养一段时间后(一般2h左右)吸出微通道内的培养基,利用微量分光光度计600 nm处测定吸光值,将检测组细菌密度低于对照组密度30%的视为敏感,目前该技术对于MIC值的判定还未建立相关标准。

针对生物膜的药敏试验

生物膜(Biofilm)是由微生物及其分泌的有机物积聚而成,它广泛存在于各种自然环境及临床医疗事件中,常规药敏试验结果获得的MIC及最小杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)往往只能对游离状态的细菌起作用,而对生物膜中的细菌难以奏效且容易使细菌产生耐药性,因此针对能形成生物膜的细菌需要建立相应的药敏试验。为了让待检菌在人工培养条件下易于形成生物膜,需要人为制备或修饰附着基质,目前可利用聚苯乙烯微孔板和含泊洛沙姆水凝胶( Poloxamer Hydrogel)的MH琼脂平板等,再结合传统稀释法和扩散法药敏试验方法进行检测。在终点结果判读和判定时,利用泊洛沙姆水凝胶平板结合稀释法和扩散法进行的药敏试验可直接根据菌落生长情况和抑菌圈大小进行结果判读;利用聚苯乙烯微孔板结合稀释法进行的药敏试验,可结合ATP生物荧光法对生物膜中存活菌体数量进行检测实现对药敏效果的判断,目前这方面技术仍处于初步研究和摸索阶段。

基于辅助显色试剂的快速药敏检测

药敏试验表型检测在终点判读时可以利用一些显色剂来辅助实现便捷、快速、准确、直观的判读。根据活菌具有产生ATP、氧化还原及水解酶等活性,可以利用ATP生物荧光法,氧化/还原指示剂四甲基偶氮唑盐(MTT)和刃天青等,以及水解后产生荧光的FDA和钙黄绿素AM(Calcein-AM)等。其中荧光显色剂需要专门配有荧光激发装置的仪器配套使用,而氧化还原指示剂不仅可以利用分光光度法进行定量检测,其颜色的变化肉眼也容易做定性判别,因此作为药敏检测常用的显色试剂,已被用于便捷、快速药敏试剂盒的开发研制。黄色的MTT能被活细胞内的还原力还原成蓝紫色的甲瓒(Formazan)结晶物,而死细胞则无这种能力,甲瓒可溶解于酸化异丙醇或二甲基亚砜(DMSO)中呈蓝色溶液,它的颜色可与活细胞数成正比,所以根据OD值来反映存活细胞的变化。刃天青是一种安全、稳定、易溶于水且对细胞无毒的新型染料,可通过荧光产生或颜色变化指示细胞的代谢。活细胞能够将蓝色的氧化态转变成红色的还原态,同时发生可量化的荧光变化,荧光的强度或红色的强度反映了细胞增殖的程度,其颜色变化可用酶标仪测定,荧光变化可用荧光测定仪检测,使用荧光方法时具有更优秀的敏感性。

耐药基因检测

抗生素作用于淋球菌有多个靶基因。壮观霉素和阿奇霉素结合到核糖体上抑制蛋白质的合成。编辑16S和23S rRNA的基因如果出现某些突变就会导致淋球菌对壮观霉素和阿奇霉素的敏感性降低,即出现耐药性。氟喹诺酮的抗菌机理是通过抑制参与DNA复制过程的拓扑酶的活性。拓扑酶编码基因包括gyrA和parC,这两个基因如果出现突变会导致淋球菌对喹诺酮类药物的敏感性下降。β-内酰胺酶类抗生素与青霉素结合蛋白(penicillin binding protein)PBP1和PBP2结合抑制糖营的合成。孔蛋白(Por B)是一种重要的外膜蛋白,结构改变会引起抗生素进入淋球菌的通透性降低,从而引起耐药。质粒编码的TEM-1青霉索酶(blaTEM-1)水解青霉素的β-内酰胺环,赋予了细菌使青霉素失活的能力。

因此可以通过直接测定上述相关基因的突变或上述基因的存在与否来确定细菌的耐药性。测定耐药基因相关基因是否发生突变一般的过程是提取核酸、扩增靶序列,测序,与未耐药的参考株进行比较,找到耐药相关的突变位点。、确定耐药基因是否存在时可以直接扩增该蒯药基因,然后通过电泳检测或直接用实时荧光检测。

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