生物发光(bioluminescence) 是在自然界广泛存在的、有生命的生物产生的一种发光现象。发光的生物种类很多,包括发光细菌、发光萤火虫、发光鱼、发光海星、发光甲虫等。而能催化荧光素或脂肪醛氧化产生生物发光的一类酶即为荧光素酶(luciferase)。1954年,Meclroy等对从哈氏弧菌中提取并纯化出细菌荧光素酶,1967年Friedland等对从费氏弧菌中提取出的荧光素酶的结构和反应原理进行了分析。1956年Green等首次提取出萤火虫荧光素酶。Marlene等(1986年)成功地获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)。目前,荧光素酶的应用和发展进入了一个崭新的时代,应用荧光素酶大大增加了生物发光免疫分析技术的灵敏度和应用范围,并且由于具有敏感性高、特异性好、反应迅速、操作简单、应用范围广等优点,已成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手段。

荧光素酶参与生物发光反应

不同种类发光细菌的发光机制是相同的,是由特异性的荧光素酶、还原性的黄素(FMNH2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)、氧分子(O2)所参与的复杂反应,在450~490nm时发射蓝绿光。

反应中,反应底物、FMNH2、RCHO和产物FMN都结合在α多肽亚基的有限区域。β亚基的作用虽然未知,但有的研究者认为β亚基仅仅是为了维持α亚基的活性的构造。研究中还发现,在RCHO缺乏的情况下,荧光素酶也可以催化FMNH2和O2反应,生成FMN和H2O2,但只能发出极其微弱的光。而在RCHO存在的条件下则可以发出持续的、稳定的荧光。反应中的FMN、RCHO、O2、BL、pH和温度都会影响细菌荧光素酶的活性。

荧光素酶用于胰岛自身抗体检测

Burbelo等首次将荧光素酶免疫沉淀技术(luciferase immunoprecipitation,LIPS)应用于胰岛自身抗体检测,蛋白酪氨酸磷酸酶-2(IA-2,氨基酸序列601~979)克隆到Renilla荧光素酶(Ruc)的pREN2哺乳动物表达载体下游,并转染猴肾细胞(Cos1)48h,采用超声裂解细胞并离心,抽提液不需进一步纯化即可用于抗体检测。抗体检测时,首先用光度计检测抽提液的荧光素酶活性,并稀释调节为每0.1μl抽提物含荧光计数1.0×107光形成单位。然后1.0μl血清与稀释后抽提物混合,保持总反应体积为100μl,在室温下反应1小时。反应物随后转移至包含7μl 30%蛋白A/G颗粒悬浮液的96孔过滤平板中孵育1小时。随后,捕获抗体-荧光素酶标记的IA-2复合物的蛋白A/G颗粒采用BioMek-FX型液体工作站进行洗涤,加入Renilla荧光素酶基质,采用微量平板光度仪计数光形成单位。

该方法检测结果与经典的放射免疫沉淀法(RBA)相关程度高(R2=0.805),ROC曲线下面积为0.985 (95% CI 0.956~0.997),仅双孔变异系数(CV)略大于RBA法(9.3% vs.5.0%)。随后,2010年Burbelo等又建立了GADA和IA-2βA的荧光素酶检测技术,除了采用了全长的GAD65或IA-2β胞内aa662~1033克隆到Renilla荧光素酶(Ruc)的pREN2哺乳动物表达载体下游,其余步骤同IA-2A检测。研究发现,在检测GADA和IA-2βA上,LIPS与经典的RBA法具有相似的灵敏度和特异性(GADA:LIPS灵敏度77.6%,特异性97%;RBA灵敏度77.6%,特异性95%。IA-2βA:LIPS灵敏度62.5%,特异性100%;RBA灵敏度51.0%,特异性98.5%),ROC曲线分析显示曲线下面积两者也无差异。研究也发现LIPS变异系数(CV)大于RBA法(13.5% vs.3.1%)。

LIPS法具有以下优势:

  1. 它不需要使用放射性核素,所以能较易在各级实验室推广和应用。
  2. 不需要经过体外转录/翻译,就抗原制备来说,较RBA法更经济一些。
  3. 由于重组蛋白是与荧光标记物融合,所以不需要额外的标记和工作量大的与哺乳动物细胞裂解液中其他蛋白质分离步骤,因此去除了纯化过程,而这过程在以细菌制备的蛋白质用于ELISA法中,是必需的。
  4. 因为蛋白来源于哺乳动物细胞,经历了一系列过程,在体或体外转录/翻译过程中的翻译后的修饰将不可能发生,因此,更真实地反映抗原的天然状态。然而,目前该方法的稳定性,特别是变异系数较大等问题,尚需进一步改善。
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