为什么可以选择异硫氰荧光素等作为流式细胞术分析的荧光探针?

答:流式细胞技术的发展在很大程度上归功于现代单克隆抗体技术的发展。各种荧光探针标记的单克隆抗体,不仅使传统的免疫学检测实现了定量分析,更为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。而荧光探针的选择对于流式细胞分析的结果至关重要,理想的荧光探针应满足以下4个方面的要求:

  1. 对激发光有较强的吸收,从而降低背景噪音;
  2. 要有尽可能高的光子产量,提高信号强度;
  3. 激发光谱与发射光谱之间要有尽可能大的差距,减少背景信号对荧光信号的干扰;
  4. 易于与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不会影响被标记物的特异性。

以异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)为例。FITC是一种最为常用的荧光探针,其相对分子质量为389.39,最大吸收峰为495nm,用488nm的激光激发后发射荧光的峰值在520nm附近,使用(530±5)nm的带通滤光片可得到最佳的荧光检测信号。FITC及其衍生物以共价键方式标记在多种抗体、抗原、亲和素、蛋白和抗生蛋白链菌素上,每个结合物上可结合3~5个FITC分子。FITC具有很高的量子产量和能量转换效率,经测试,约有一半的吸收光子可转换为发射荧光,与488nm的激发光相匹配,是一种优良的荧光探针。但是,须注意FITC的荧光强度可受pH的影响,当pH降低时其荧光强度也随之减弱。

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