荧光免疫与时间分辨荧光免疫激素测定方法与应用

时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)的问世是继RIA后,超灵敏度检测技术中的又一突破性进展,两法检测结果均有较好的一致性。但在建立TRFIA检测方法或组装试剂盒中也会遇到一些实际问题,如对器材的清洁度和试剂的纯度要求较高

微量滴定板的质量要求严格

TRFIA技术(无论是双位点夹心法,还是竞争法,从加样、免疫反应到最后荧光信号的测量均在特制的12孔微量滴定条或96孔微量滴定板上进行)对专用聚苯乙烯微量滴定条(板)的质量要求相当严格。滴定条(板)的孔如同普通荧光光度计上的比色杯,测量时的激发光谱和发射光谱呈90°角,故孔的四周和底部必须均一且高度透明。此外,微量滴定条(板)作为固相包被抗原衍生物或抗体IgG的载体,又必须具备对蛋白质有较大的物理吸附性能及最低自然荧光本底。

增强液影响待测物最低检测限

TRFIA技术的最低检测限能达到10-19mol/L,除测量仪器外,荧光增强液的增强效力是十分重要的因素。增强液增强荧光的效力一般能达100万倍。这给配制增强液带来一些困难。试剂纯度不高、器皿清洁度不良或不明原因的污染均可导致增强液荧光本底升高,降低灵敏度。因此,必须使用高纯度的试剂。器皿除经常清洗外,还要用10g/L EDTA·Na2浸泡,再用三蒸馏水洗涤。所配制的增强液经鉴定合格后,分装至100ml塑料瓶中可长期置4℃下保存。

增强液中的主要成分是β-二酮盐(β-diketonate)。这是一种螯合剂系列,对镧系元素中的Eu3+(铕)、Sm3+(钐)、Tb3+(铽)、Nd3+(钕)和Dy3+(镝)均有很强的螯合作用。在TRFIA检测技术中,免疫复合物中的Eu3+(pH<4.0)解离出来,和增强液中的β-二酮盐结合生成一种新的螯合物;在含有不同结构的β-二酮盐的增强液中,镧系元素中的不同离子所发生的激发光谱、发射光谱、衰变时间及相对荧光强度均不相同(下表)。所以应用何种镧系离子标记,都要根据其特性来配制相适应的增强液。常用的增强液配方如下:①β-萘酰三氟丙酮(β-NTA)4mg;②三辛基氧化磷(TOPO)19.2mg;③邻苯二甲酸氢钾1.3g;④冰醋酸6ml;⑤TritonX-100 1ml;⑥三重蒸馏水至1000ml(pH2.8~3.5)。

β-二酮盐系列对镧系离子的荧光特性

β-二酮盐系列对镧系离子的荧光特性

注:β-NTA:β-萘酰三氟丙酮;PTA:三甲萘乙酰三氟丙酮;BTA:苯甲酰三氟丙酮;*:比较发射最大波长的积分面积,以Eu3+-β-NTA 为100

Eu3+-β-NTA螯合物增强荧光强度要在三辛基氧化磷(tri-N-octylphosphine oxide,TOPO)的协同作用下实现。TOPO的作用原理是将Eu3+的配位水分子排至第一配位层。在非离子表面活性剂TritonX-100的作用下,螯合的Eu3+形成微囊状态。这种微囊的内侧为疏水性,可溶解脂溶性β-二酮盐,其外侧为亲水性,可与水分子相结合,故微囊受到紫外光激发时可以阻止能量向水中散去,从而达到排除水对荧光的淬灭作用。

Topo和NTA对Eu3+的协同作用原理示意图

Topo和NTA对Eu3+的协同作用原理示意图

时间分辨荧光免疫易产生内源性或外源性污染

自然环境中镧系离子十分广泛。如空气的灰尘和烟雾中均有不同程度的含量(尤其以北方地区为甚)。如何防止器材、试剂和操作不慎可能造成的污染已成为建立TRFIA技术的关键。

  1. 器材:该技术所用的一切器材,包括聚苯乙烯微量滴定条(板)、移液管、加样器头、试剂瓶必须专用。为了保证高清洁度,洗涤程序是:先经2mol/L盐酸浸泡24小时,10g/L EDTA·Na2液浸泡24小时,自来水冲洗,最后经高纯度蒸馏水冲洗,45℃干燥后置塑料袋内,封闭贮存。
  2. 试剂的本底荧光:新配制的试验缓冲液(PBST洗涤液)的自然本底荧光须进行测量。方法是:取试剂25μl加至微量滴定条(板)孔中,再加增强液200μl,置振荡器上振荡20分钟后测量荧光。如果发现试剂的荧光强度(CPS)高于增强液50%以上,应重新配制。
  3. 操作规程:操作者必须严格执行操作规程。不得用手直接接触加样器头的尖部或微量滴定条(板)的孔部。反应过程中微量滴定条(板)的表面贴一张同等大小的透明胶纸防止空气中灰尘可能造成的污染。Eu3+标记物的制备不得在同一实验室内进行,避免大剂量的EuCl3污染环境。(彭健 谢辉)

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