发光免疫分析激素测定临床应用与影响因素

发光免疫分析用于临床诊断和疾病监测

已成为激素类商品试验盒的有:T3、T4、FT3、FT4、TSH、hPTH、HCG、皮质醇、雌二醇、黄体酮、FSH、孕酮、睾酮、孕二醇-3α-葡萄糖醛酸盐、雌三醇-16α-葡萄糖醛酸盐、雌酮-3-葡萄糖醛酸盐、胰岛素、C肽、降钙素、甲状腺素结合球蛋白、T3摄取率、生物素、Ⅰ型胶原氨基末端前肽(PINP)、N末端脑钠肽(N-BNP)等。此外,还有铁蛋白、前列腺特异性抗原(PSA)、肌酸激酶(CK-MB)、IgE、β2-微球蛋白、EGF、IL-6、IL-2、CEA、AFP、CA19-9、CA125、HBsAg、HBsAb、抗-HCV、载脂蛋白B100(APOB100)、地高辛、茶碱、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、细胞表面IgG、人血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体、人血清N末端-B型利钠肽(NT-proBNP)和抵抗素等也可用发光免疫分析技术进行检测。

ECLIA还可定量检测由相关基因转染的人T细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)的mRNA水平;也可将T细胞的mRNA提取后反转录成cDNA,用一对分别标记钌和生物素的引物进行扩增,再用ECLIA检测其扩增产物;ECLIA还可直接测定细胞因子mRNA的表达。化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析已实现了仪器分析自动化,测定实行全自动化控制,减少了人为操作因素的影响,分析速度快,如ACS180分析仪出第一个结果只需15分钟,然后每20秒出1个结果,每小时可测180份样品,也可随意插入急测标本,且方法的检测灵敏度、精密度和准确度均优于放射免疫分析技术。

研究发现,用发光免疫分析法测定血液病患者血清中G-CSF的检测灵敏度为0.5pg/ml,而酶免疫分析法和放射免疫分析法的灵敏度为30~50pg/ml。还证实用化学发光免疫分析法测定胰岛素原,不会与胰岛素和C肽发生交叉反应,且方法操作简便,与放射免疫法、酶免疫法和荧光免疫法比较,用发光免疫分析法检测胰岛素原最为敏感。而在几种发光免疫分析法中,以亲和素-生物素反应增强化学发光酶免疫分析法最敏感,检测灵敏度范围可达attomole (10-18 mol/L)和zeptomole (10-21mol/L)。发光免疫分析技术还可作为检测器,与HPLC、毛细管电泳或流动注射分析联用。

发光反应类型和干扰因素是影响发光免疫分析的主要因素

发光免疫分析法是以化学发光或生物发光为基础并与抗原抗体反应相结合的一类分析技术,因此,影响化学发光或生物发光反应的各种因素均可能影响发光免疫分析的结果,其中发光反应的类型和某些干扰因素是影响发光免疫分析的主要因素。

发光反应的类型

发光反应释放的光子强度随时间的变化关系存在3种类型,如下图所示。鲁米诺和吖啶酯类发光反应体系所产生的化学发光一般要在数秒钟内进行测定,因为在反应物混合之后其光子以闪光形式发射(下图A),发光强度随时间迅速衰变,只能在待测位置将反应物进行混合才能有效测试到反应产生的最大发光强度。而电化学发光反应或过量萤火虫发光素和纯发光素酶的反应可产生稳定、连续高效的发光(图B),这种发光类型可大大提高检测的灵敏度。当发光反应用做酶反应产物(如ATP、NADH或H2O2)的测定时,产生的光强度随反应时间的延长呈持续增加趋势(图C),其检测灵敏度可随反应的温育时间不同而不同。

发光强度与反应时间的关系

发光强度与反应时间的关系

注:↑:开始反应时间;A:发光强度随时间迅速衰变的发光反应;B:发光强度在某时间内保持稳定的发光反应;C:发光强度随时间延长而持续增加的发光反应

干扰因素

免疫学分析技术也像生化分析技术一样,是根据组成类似于待测样品的参考物来进行定量的,通常的干扰因素可通过测定参考物来消除,但一些较强的干扰因素仍可影响测量结果,如样品的混浊度增加(如严重溶血或黄疸、乳糜样血清等)可使测定灵敏度下降,因为光度计只能测定从反应体系中发射的总光量,不包括散射光的量。样品中含有的较强的吸收光和发射荧光的物质也可影响测定结果。发光反应产物的颜色随pH值而变化,因此反应体系的pH值可影响发射光谱和光强度的检测。发光反应呈温差依赖性,温度变化不仅影响反应速率,而且可使光谱漂移。高浓度的盐类和缓冲液可以抑制发光素酶的活性和干扰反应,但此种干扰可借稀释作用予以降低或消除。此外,血清中某些影响发光的物质,如腺嘌呤核苷和直接引起发光反应的酶类及某些药物也可能成为未知的干扰因素,但在固相免疫或电化学发光免疫分析中容易借洗涤或磁铁吸附磁性微球(非结合相被流动的液体冲走)予以消除。

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