睾酮检测:放射免疫测定法、CLIA法、ECLIA法

男性体内的睾酮几乎全部由睾丸间质细胞合成。分泌受黄体生成素(LH)的调节,并负反馈影响垂体-下丘脑的调节机制。睾酮促进男性第二性征的形成,维持前列腺和精囊的功能。检测男性体内睾酮含量可用于诊断睾酮产生不足的疾病,如性腺发育不足、雌激素治疗、染色体异常(如Klinefelter综合征)。睾酮的测定方法有多种,本节主要介绍RIA法、CLIA法、ECLIA法。

放射免疫测定法

甾体激素由于其不溶于水的特性,所以为了便于输送总是与特定的蛋白(性激素结合球蛋白)结合,使其能溶于体液中。甾体激素与性激素结合球蛋白有一定的亲和力(过去的竞争蛋白结合测定法就是利用这一点来进行的),它势必影响甾体同抗体的结合。因此甾体激素的测定往往要用有机溶媒提取,以打破甾体分子同结合蛋白的结合,使其游离出来,再同抗体结合。提取——重溶过程也可以使标本稀释或浓缩,以使其浓度值落在标准曲线内,以利准确地测定。125I标记的抗原可以不用提取。

原理

① Ag+Ag+Ab1[AgAb1]+[AgAb1

含睾酮的样品与125I标记的睾酮衍生物与其相应抗体(一抗)反应形成抗原抗体复合物。

②[AgAb1]+[AgAb1]+Ab2→[AgAb1]Ab2↓+[AgAb1]Ab2

在①反应达到平衡后加入第二抗体及PEG,使游离部分与结合部分分离。离心后,用γ-计数器测量沉淀部分的放射性强度。

材料

  1. 125Ⅰ睾酮标记物:含<10μCi的125Ⅰ标记的睾酮衍生物,PBS和0.1%叠氮钠。
  2. 抗睾酮抗体(Ab1):含兔抗人睾酮抗体,PBS和0.1%叠氮钠。
  3. 睾酮标准物:以人血清为基质,睾酮浓度为0、10、50、100、250、500、1000、2000ng/dl溶液并含0.1%叠氮钠。
  4. 质控(Q.C)血清(1.0ml/瓶)。在人血清中含正常男性和正常女性睾酮浓度溶液,并含0.1%叠氮钠。
  5. PEG-第二抗体(Ab2)溶液,含PEG和驴抗兔抗体及0.1%叠氮钠。

方法

见下表。用聚丙烯试管编号后按表32-1依次进行。

睾酮检测

睾酮检测

充分混匀,1500g离心20min,弃上清液用γ-计数器测定各管放射性强度。

结果计算

一、测每份标本双管的cpm值并计算出平均数。

二、按下列公式分别计算出各标准管,质控和患者标本的B/B0%:

其中B为每对试管计数率的均值,B0为0标准物双管计数率的均值,NSB为非特异结合双管计数率的均值。

三、以各标准管B/B0为纵轴,标准物浓度(ng/dl)log值为横轴,在半对数坐标纸上绘制标准曲线。

四、在标准曲线上查出质控血清及各标本的睾酮浓度。

注意事项

一、在正常成年男性中,95%的睾酮是由睾丸产生的,肾上腺分泌少量睾酮,循环睾酮大多数与蛋白质结合,极少部分在血中呈游离状态存在,并有代谢活性。血睾酮含量在一天中有节律性变化,上午含量最高,高峰时间在清晨4:00~9:00,所以采血时间一般应定在上午6:00~9:00空腹时。一般临床诊断可在这一时间内取单次血样。若为科研目的或为求得确切浓度,最好在上述时间每隔30min采血一次,共取3~4次求其平均值,或每天采血一次连取几天。每个实验室都应建立自己的正常值范围,应测定10个以上正常成年男性(年龄20~50岁,有生育力,精子计数正常),10个以上月经期女性,并重复采血多次。老年男性和绝经期妇女睾酮水平较低。下列数据仅供参考:成年男性(20~35岁)外周血浆睾酮含量为20.9±7.1nmol/L(596±202ng/dl),成年女性(20~35岁)为1.6±0.7nmol/L(46±21ng/dl)。

二、血清标本严重溶血者不能使用,如需要可-20℃保存,2~8℃保存不应超过2d。

三、弃上清液时不得丢失沉淀物,否则会明显影响结果。

四、样品中睾酮浓度>2000ng/dl时,需用0标准稀释后再做。

五、本试验属放射性同位素,故一切操作和处理应按放免实验操作规定进行。

CLIA法

原理

此方法使用了一种置换剂,把结合态T从性激素结合球蛋白(SHBG)中置换出来,这样就可以测定血液中的总T含量。

37℃孵育后,加入过量的结合着磁性微粒的抗荧光素抗体,它快速地与T衍生物-T抗体复合物发生特异性结合。在外加磁场中直接沉淀,不需离心即可分离,倒去上清液,清洗沉淀的复合物,然后加入酶促发光底物。底物在酶的作用下被催化裂解,形成不稳定的激发态中间体,当激发态中间体回到基态时便发出光子,形成发光反应,即可使用发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内,发光强度与样本中的T浓度成反比,通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的T含量。

试剂

  1. T试剂1:含碱性磷酸酶标T衍生物;
  2. T试剂2:含荧光素标T抗体;
  3. T标准品:包括浓度分别为0、0.5、1.0、4.0、8.0和17.0ng/ml(0、1.74、3.47、13.9、27.8和59nmol/L);
  4. 分离试剂:内容物含包被着抗荧光素抗体的磁性微粒;
  5. 清洗液浓缩液:内含表面活性剂、防腐剂;
  6. 底物溶液:含酶促化学发光底物;
  7. T质控品:为冻干品,含一定量的睾酮。

操作及质量控制

不同型号的仪器操作程序不同,若使用自动化的仪器,则由仪器自动操作所取代,请严格按照仪器使用说明书执行。

T质控品测定值应在规定范围内。

男女参考范围

  1. 男性:8.36~39.59nmol/L
  2. 女性:0.52~3.47nmol/L

不同地区、不同个体、不同设备以及不同方法进行检测,所测得的睾酮水平也有所不同,建议各实验室建立自己的正常值范围。

注意事项

  1. 标本应放-20℃贮存,避免反复冻融。
  2. 试剂应贮存在2~8℃冰箱内,在有效期内使用,不同批号试剂盒不能混用。
  3. 待测标本及试剂上机前均应恢复至室温。
  4. 避免严重溶血、高脂血症、黄疸、碱性磷酸酶活性高的标本;
  5. 患者在采集标本前,不得接受放射性治疗或体内同位素检查。口服避孕药与T有交叉反应。妊娠或服用卵磷脂、丹娜唑、19-去甲T等均影响测定结果。

ECLIA法

原理

待测抗原(T)、钌标记的T竞争性地与生物素化的抗T单克隆抗体结合,待测抗原(T)的量与钌标记的T和生物素化的抗T单克隆抗体所形成的免疫复合物的量成反比。加入链霉亲和素包被的微粒,免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。在磁场作用下,微粒通过磁铁吸附到电极上,未结合的物质被清洗液洗去,电极加电压后产生化学发光,通过光电倍增管进行测定。

试剂

购买与仪器配套的试剂盒,主要包括以下几种试剂。

  1. 链霉亲和素包被的微粒,0.72mg/ml;
  2. 生物素化的抗睾酮单克隆抗体浓度,40ng/ml;
  3. 钌(Ru)标记的睾酮多肽;
  4. 质控(Q.C)血清。

操作

不同型号的仪器操作程序不同,请严格按照仪器使用说明书执行。首先分离血清上机,包括加样、分离、搅拌、温育、打印结果,各操作均由仪器自动完成。

  1. 质控分析:各浓度质控至少每24小时内检测一次,每次更换试剂盒或定标后也须进行质控。每个实验室可根据各自的情况设定合适的控制限和质控周期。质控值必须处于规定的控制限度内。若失控每个试验室必须采取相应的纠正措施。遵循各地关于质量控制的有关规定。
  2. 定标:新批号试剂必须进行定标(新试剂盒在分析仪上放置不能超过24小时)。以下情况建议重新进行定标:使用同一批号试剂,1个月后(28d);7d后(同一试剂盒在分析仪上使用);根据需要:如失控。
  3. 样品分析:请遵照本说明书中有关分析仪的相关指导,并参照分析仪操作手册。包括试剂装载,仪器检测,样本分析。
  4. 样本分析后,对标本结果进行审核并打印。

男女、儿童参考范围

  1. 男性:9.9~27.8nmol/L
  2. 女性:0.22~2.9nmol/L
  3. 儿童:0.42~38.5nmol/L

不同地区、不同个体、不同设备以及不同方法进行检测,所测得的睾酮水平也有所不同,建议各实验室建立自己的正常值范围。

注意事项

  1. 标本应放-20℃贮存,避免反复冻融。
  2. 试剂应贮存在2~8℃冰箱内,在有效期内使用,不同批号试剂盒不能混用。
  3. 待测标本及试剂上机前均应恢复至室温(20℃左右)。
  4. 由于蒸发因素的影响,样本、定标液及质控品在分析仪上的检测必须2小时内完成。
  5. 避免试剂和样本(样本、定标液和质控品)产生气泡。

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