核素标记技术:35S标记技术

采用氯胺T标记法获得125I标记GAD(或IA-2)抗原而建立的放射免疫法检测GAD-Ab或IA-2A,因可能在标记过程中对抗原部分损伤或掩蔽了部分抗原表位而导致灵敏度下降。笔者的研究结果证实,采用125I标记GAD检测GADAb灵敏度不及采用35S标记GAD(灵敏度仅相当于35S标记GAD的73.9%)。下面介绍35S标记胰岛自身抗原技术。

35S标记胰岛自身抗原具有较高灵敏度

采用人GAD65(或IA-2)cDNA插入到原核表达质粒pcDNAⅡ-SP6启动子下,构建重组质粒,并转化宿主菌E.coli. DH10B,通过原位杂交筛选出含重组质粒的阳性菌落,碱法提取质粒进行酶切和测序鉴定。将连接正确的重组质粒在转染的E.coli.DH10B中繁殖扩增,并抽提纯化质粒。

材料

去RNA酶吸头(10μl和100μl两种)和Eppendorf管(1.5ml),经DEPC处理后高压灭菌(30分钟),放入56℃烤箱内烤干后备用。TNT quick transcription and translation kit (L2080,Promega公司),运输途中需干冰保持温度-70℃以下,因-70~-50℃温度变化影响兔网织裂解液的活性,故贮藏kit的冰箱门尽量少打开,尤其不要与其他常用的试剂放在同一个冰箱中,以免在取别的试剂时频繁开关冰箱门而影响内部温度,导致兔网织红裂解液失效。35S-Met SJ-1515(18.5MBq/33μl,Amershampharmacia公司)在运输途中须干冰保持温度-70℃以下,收到后必须检查运输盒中是否尚存干冰,且立即放-70℃低温冰箱保存。

操作过程

可分为以下步骤:

  1. 打开制冰机2小时后,取出一满桶冰置4℃冷库中备用。为防止冰在短时间内融化,桶的体积不能太小且尽量使用刚制出的冰。
  2. 打开循环水浴箱,调整温度至30.0℃。
  3. TNT kit中取出一管兔网织红,用双手握住使之解冻后,用手指轻轻拨动管底,摇匀而不产生气泡,于2000g离心力下离心2分钟,使管壁黏附的兔网织红聚集于管底,以便充分利用。离心后,取出置于刚制出的冰上保存。
  4. 取出35S-Met SJ-1515、RNA-Free水、GAD质粒(500ng/μl)和Control质粒,4℃解冻后置冰上备用。
  5. 操作均在4℃冷库中进行,加样吸头和Eppendorf管应经去RNA酶和消毒处理,Eppendorf管需注明项目和标记日期,管底应置于冰上;加样时应尽可能准确,尽量加在管底且不产生气泡;加样后的废吸头按放射和非放射废物分类,分别弃入已放好垃圾袋的塑料桶中,放射性废吸头按国家有关规定统一处理。
  6. 用手指轻轻拨动Eppendorf管底,使反应物混匀,切忌幅度过大而产生气泡;2500g离心30秒后,置循环水浴箱30℃孵育2小时。
  7. 取出置于冰上分装,每50μl管可分装4小管,每小管12.5μl。取1管用于测标记效率置于冰上待用,其余均用记号笔写好项目和标记时间后,集中放在标记抗原盒中,盒上注明项目和标记时间,置-70℃冰箱保存备用。

标记物的纯化

经上步标记的步骤后,采用两种方法对标记产物进行鉴定和纯化。

  1. TCA沉淀法:从TCA沉淀法可知35S的百分掺入率。进行下步标记抗原的稀释和与血清孵育时,通常采用加入TCA可沉淀的放射性计数为30 000~40 000标记的抗原。该方法在胰岛自身抗体的平板微量检测法上应用广泛,游离35S-met和标记的杂蛋白在反复洗涤后被去除。但因其并未纯化标记物,对于试管检测法则因非特异性吸附增加,而导致背景放射性计数值增高和信噪比降低。目前试管法均采用了下面的层析法纯化标记抗原。
  2. 层析法:经SDS-PAGE和放射自显影证实,即为所需的标记抗原,可用于胰岛自身抗体的试管法检测。层析后的Sepharose-25柱经25ml TBST缓冲液洗涤后尚可使用1次,废柱应严格按放射性废物加以处理。

胰岛自身抗原核素标记有重要进展

经典的放射配体法常分别标记GAD与IA-2,嵌合蛋白法联合检测法构建嵌合蛋白,利用该蛋白能同时结合GADAb与IA-2A的特性而进行同步检测。嵌合蛋白标记法联合检测胰岛自身抗体在临床上大规模应用前尚有一些问题有待解决:

  1. 检测结果重复性问题,特别是同一标本间隔较长的时间两次(或更多次)的变异情况未见报道;
  2. 检测结果标准化问题尚未进行研究;
  3. 在体外转录/翻译过程中,35S掺入的放射量因TNT试剂盒批号不同而变异大,在108 000~231 000之间,难以控制和标准化。然而该方法能节约时间和费用,目前国际学者仍在坚持不懈地进行研究。

研究证实,在筛查成人起病缓慢需要胰岛素治疗的LADA患者中,GADA+IAA结合检测优于GADA+IA-2A。GADA和IAA同时出现者与快速需要胰岛素治疗相关联。而且IAA阳性但GADA/IA-2A阴性的个体缓慢发展为胰岛素依赖型。所以,一步法联合检测GADA和IAA将有实用价值。

目前检测IAA最有效的方法为采用核素125I的微量平板放射免疫法,而检测GADA最有效的方法为采用35S的放射结合分析法。两者采用的标记核素不同,而且同时分离结合/游离抗原尚存在难度,无法实现一步法联合检测。如果采用GADA一样的方法,由cDNA通过体外转录翻译获得35S-胰岛素,将面临很大的难度。因为商用的真核系统缺乏专用工具将单链胰岛素原加工为双链、二硫键连结的成熟胰岛素,故可能的途径只能先合成35S-胰岛素原。碘元素相对于酪氨酸残基属体积较大的配基,被化学修饰而引导进去,故可能改变表位或通过氧化作用造成抗原的损害。就胰岛素原与成熟的胰岛素而言,虽然抗体针对的表位主要免疫反应位于胰岛素上,胰岛素原或位于胰岛素原上的C肽等自身反应性并不干扰成熟胰岛素的反应性。故采用35S-胰岛素原将为自身免疫糖尿病的表位谱提供一个新的思路。为此,可以采用两步设计和实验,建立一步法检测GADA和IAA。

第一步,先采用35S标记胰岛素原。编码人胰岛素原(PI)的基因采用PCR方法从pGem3Zf-PPI中使用两条引物CCCAGCCATGGCCTTTGTGAACCAACACCTGT和TTTATTCGAGCTCTCTCGGTGCAGGAGGCG进行扩增。扩增产物在3′和5′末端插入了NcoI和SacI位点。PCR产物经消化后,掺入pSP64-NcoI的NcoI/SacI位点产生pSP64-PI。最后经测序鉴定。pSP64-PPI 与pSP64-PI采用兔网织红细胞裂解液系统和35S-半胱氨酸转录与翻译。翻译后产物(50μl)用50μl pH 8.5包含0.2M DTT的100mM Tris-HCl在室温下孵育2小时,再采用PD10柱进行凝胶过滤层析。加入0.1%抑肽酶,并在4℃下进行透析启动折叠。透析条件:0.5mmol/L L-精氨酸,50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,5mmol/L GSH和0.5mmol/L还原型谷胱甘肽,pH 9.5。在经过一晚的蛋白质折叠后,采用HPLC分离35S-PI。纯化的35S-PI能够用于IAA检测,且易于与GADA和IA-2A一样标准化。

第二步是建立一步法同时检测GADA和IAA/PAA的方法。30μl血清与含有1000CPM的35S-PI及500CPM的35S-GAD的90μl RBA Ⅱ缓冲液4℃孵育7天(条件经优化)。然后,加入50%蛋白G-琼脂糖4B FF 50μl沉淀物经洗涤后加入闪烁液进行放射性计数。该方法与单独指标检测匹配性很好。

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