核素标记技术:32P 标记技术

32P标记用于细胞代谢和蛋白磷酸化研究

放射性标记法研究蛋白质磷酸化的传统方法是将放射性核素32P标记到磷酸化蛋白质上,经一维或二维凝胶电泳进行分离,然后通过放射自显影来检测磷酸化蛋白质。若要进一步分析磷酸化位点,则需要通过蛋白酶解消化,再通过Edman降解或质谱对肽段进行测序。此方法的灵敏度高,其局限性在于为获得高特异性标记,需要大量的放射性32P,也需要大量的磷酸化蛋白质。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化/去磷酸化代谢速率不同,所以掺入32P的速率也不同。对某些磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质,可能检测不到。

Salih等32P标记骨桥蛋白(OPN)的操作步骤是:

  1. 将17天鸡胚颅骨采用持续胶原酶/胰蛋白酶处理,分离其成骨细胞;
  2. 将分离的成骨细胞在含10%小牛血清、12.5μg/ml维生素C和10mmol/L β-磷酸甘油的BGJb培养基中培养3周,以促使细胞外基质矿化;
  3. 将矿化的培养物在无磷酸盐的达尔伯克改良伊格尔培养基中预孵育1小时;
  4. 在上述含12.5μg/ ml维生素C的培养基中加入37MBq 32Pi/培养皿,孵育1小时;
  5. 将蛋白提取缓冲液与洗涤缓冲液均预冷至4℃;
  6. 移去培养基,矿化细胞层用10ml 的10mmol/L (pH7.2)磷酸盐缓冲液洗涤3次;
  7. 将细胞溶于4℃包含0.5% Tween-20、0.05%脱氧胆酸、50mmol/L NaCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L NaVO3、10mmol/L NaF以及1mmol/L苯甲磺酰氟的溶液中;
  8. 移去上述反应液,用10ml的10mmol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液洗涤矿化细胞层3次;
  9. 将矿化细胞层用0.1mol/L HCl(10ml/培养皿)抽提,经酸抽提的蛋白质低压冻干,32P标记的OPN采用反相HPLC纯化。

预防糖皮质激素诱导的骨细胞和成骨细胞凋亡

钙结合蛋白-D28k预防糖皮质激素诱导的骨细胞和成骨细胞凋亡。蛋白激酶下钙结合蛋白-D28k的磷酸化研究方法如下:取双份经纯化的鼠肾脏钙结合蛋白-D28k 1μg,1份与20ng纯化的来源于鼠脑蛋白激酶在20mM MOPS液(含25mmol/L β-磷酸甘油、1mmol/L原钒酸钠、1mmol/L二硫苏糖醇、1mmol/L CaCl2和200μmol/L磷脂酰丝氨酸,pH7.2)、0.25mmol/L的ATP孵育,另1份与20mmol/L的MOPS液、0.25mmol/L 的ATP、[γ32P]-ATP 0.185MBq孵育,孵育温度均为30℃,总反应体积均为60μl。反应后加入2%SDS终止磷酸化。经3.5%~17%SDS-PAGE后,采用放射自显影技术检测32P信号。

纯化步骤:

  1. 将冻干的酸抽提物重溶于0.5 ml H2O、0.1%三氟乙酸(v/v)中;
  2. 取0.25ml注射至反相高效液相色谱中(C-4柱,14×0.38cm);
  3. 用H2O、0.1%三氟乙酸(v/v)洗涤10分钟;
  4. 用线性梯度的H2O、0.1%三氟乙酸(v/v)至60% CH3CN、0.55%三氟乙酸(v/v)在流速0.72ml/min洗提60分钟;
  5. 按0.72ml每段收集,每段取0.025ml用于32P放射性计数;
  6. 将放射性计数高峰段合并,冷冻干燥。

系统医学科普站点:天山医学院, 转载请注明出处:https://www.tsu.tw/edu/3396.html

小程序

内容拓展

中华皮肤病30年研究成果

心电图学一学就会

认识人体心脏,从解剖开始!

诱发心血管疾病的综合征

近视屈光激光手术矫正

适用于口腔科

做一个健康强健的男人!

智齿为萌出受阻的牙齿

内分泌与机体代谢医学