酶标记技术:常用标记酶的特性

酶标记技术在内分泌领域内应用较广,通常内分泌激素测定均采用该技术。

用于标记抗体(或抗原)的酶应该符合下列要求:①纯度及比活性高,且价廉易得。②性质稳定,可溶性好;而且容易和抗体(或抗原)连接,两者的活性均不受影响。③受检组织或体液中,不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。④酶的底物对人体健康无危害。其分解产物易于测定,灵敏度高,比色方便。目前较常用的标记酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。

辣根过氧化物酶纯度应大于3.0而比活应大于250U/mg

辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase,HRP)酶蛋白为含糖18%的糖蛋白(最大吸收光谱为275nm);铁卟啉是酶的活性基团(最大吸收光谱为403nm)。HRP的纯度即以两者的光密度比值(OD403nm/OD275nm)来衡量,用RZ(reinheit zhal,即纯度值)表示,但并非HRP的真正纯度,表明血红素基团在HRP中的含量。高质量HRP的RZ值应大于3.0,比活性应大于250U/mg。

HRP 的特性是:

  1. 分子量较小(40kD),标记物容易穿透入细胞内部;
  2. 酶的作用底物为H2O2,以二氨基联苯胺(DAB)为供氢体的反应产物,为不溶性的棕色吩嗪衍生物,可用普通光镜观察。此种多聚物能还原和螯合四氧化锇(OsO4),形成具有电子密度的产物,十分适合于电镜检查;以邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS为供氢体的反应产物为可溶性显色溶液,可进行比色测定;
  3. HRP在pH 3.5~12范围内稳定。对热及有机溶剂的作用亦较稳定,能耐受63℃加热15分钟;用甲苯与石蜡包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定做冷冻切片,均不影响其活性;
  4. 溶解性好,100ml缓冲盐溶液中可溶解5g HRP;并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中,故常用硫酸铵分级沉淀法分离、纯化HRP;
  5. 氰化物、硫化物、氟化物及叠氨化物对HRP的活性有抑制作用。因此,应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂,以防止HRP失活。HRP之所以是ELISA中应用最为广泛的标记用酶,主要是因为其一方面易于提取,价格相对低廉;另一方面性质稳定,耐热及有机溶剂的作用,与抗原或抗体耦联后,活性很少受损失。

Nakasato等采用HRP标记抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)抗体14G6,建立了酶免疫法检测TRACP。Khosravi等采用HRP标记抗人IgG抗体,建立了非竞争ELISA法检测胰岛素生长因子1(IGF-1),其灵敏度达0.03mg/L,批内和批间的变异系数(CV)分别为3.9%~8.8% 、2.6%~6.7%。

碱性磷酸酶双标用于研究递质共存或酶免疫测定

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)标记物常为高度聚合的大分子,穿透细胞膜的性能较差,较少用于免疫酶组织化学定位研究。AP主要用做双标记染色,研究递质共存及酶免疫测定。甘氨酸、枸橼酸盐、EDTA、巯基化合物等可使AP失活。

葡萄糖氧化酶用于酶耦联反应放大或提高反应敏感性和特异性

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)是以葡萄糖为底物的酶,供氢体为对硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT),酶促反应的终产物为不溶性的蓝色沉淀,比较稳定。从理论上讲,COD较AP、HRP为佳,因动物体内不存在内源性GOD,非特异性干扰少。但其分子量较大(160~190kD),并且有较多的氨基,在标记时易形成广泛的聚合,影响酶的活性。因此,以GOD作为示踪酶的敏感性较HRP和AP低,供氢体少,应用较局限,主要用于两种酶耦联反应放大技术,能提高方法的敏感性和特异性。在上述反应中,HRP是作为第二酶系统,利用葡萄糖氧化时生成的H2O2作为底物,催化酶促反应。酶免疫测定以葡萄糖-ABTS作为酶耦联反应的底物。酶免疫组化染色时,使用葡萄糖-DAB为显色剂。