关于皮肤药理学研究方法学概述

药理学是一门实验性科学,它以生理、生化、病理、微生物、免疫、细胞生物及分子生物学等医学前期学科为基础,因此实验研究方法多采用上述学科的基本方法。区别仅仅是研究目的不同,药理学研究药物与机体间的相互作用,皮肤药理学则重点研究药物与皮肤器官的相互关系。在注意种系差异的基础上,整体实验能较全面及真实地反映药物的综合效应,但不易阐明药物作用的具体靶位及机制;体外离体实验可针对药物作用的分子靶位,但其结论不一定能全面推断药物的整体作用。因此,体内综合性实验必须与体外分析性实验结合进行。为了增强药效对疗效的预测作用,还必须以多项药效学试验进行组合才能获得较正确的结论。

皮肤器官全层厚不过0.5~4.0 mm.因而微观药理实验和微量药物及介质的含量测定是主要的研究手段。细胞及分子水平的实验较常用,但不能忽视动物和人之间的细胞生物学及各类因子表达间的质和量的差异。
在微量检测和分析方面,细胞培养、电镜、免疫组织化学、荧光染色、酶联免疫吸附、聚合酶链反应、原位杂交、单克隆技术,酶、受体、蛋白、核酸及基因分析,放射免疫、放射标记示踪、放射自显影、核素掺人,流式细胞分析,以及紫外、荧光分光法,层析及薄层扫描法、高效液相检测法、气一质联机或液一质联机检测法等均为常用的技术和方法。

高效检测基因图表及基因表达的基因芯片技术方法的发展,人类基因图谱的绘制成功,基因功能学与分子药理学的结合形成药物基因组学,把药物靶标筛选、药效学、毒理学、药物代谢和作用机制、药物的疗效和副作用、指导临床用药等方面的研究推到崭新的阶段,从一个全新的角度评价药物的有效性和安全性。基因组学在皮肤科的应用研究目前仅有少量报道,但在皮肤科的实验、临床研究和药物研发方面提供了空前的条件和机遇。

在整体皮肤表面的实验生理或病理分析方面,检测皮肤温度、酸度、血流动力学、水分蒸发、血管舒缩、炎症红肿、皮脂分泌、色素变化等均有相应的仪器和方法,电脑图像分析更为定量、直观、数字化提供有利条件。

皮肤病基础实验研究,皮肤病新药临床前药效学、药动学、毒理学研究都离不开整体动物实验。发病机制及病理生理环节在全身的皮肤病,药物的给药途径和实验动物的选择与研究其他系统疾病没有区别,只考虑疾病模型的特殊要求,动物种系间的差异及动物与人的差异主要在体内代谢方面,而不在吸收方面;但研究皮肤局部疾病或研究全身疾病的皮肤局部表现,及进行局部给药试验时,则考虑完全不同。局部治疗,给药途径是经皮肤,而此时的皮肤实际上是有着各种不同病理改变的皮损,对药物的透皮特性可与正常皮肤显著不同。因此,局部给药时,动物种系间的差异及动物与人的差异,以及正常皮肤与异常皮损间的差异主要在经皮吸收方面。这种差异的规律性比系统代谢差异更不易掌握,因而在经皮吸收动力学试验及在揭示皮肤长期给药后对系统、器官的可能毒性的皮肤长期毒性试验时,皮肤结构和功能的种系差异会给实验带来偏差;或者是在没有皮损及在不能形成皮损的正常皮肤上给药(如毒理试验),或与临床适应证的皮损状态的差异较大的皮肤模型上给药,同样会带来误差和干扰。动物皮肤局部用药的其他特殊问题还包括:去毛方式,保持与临床一致的开放给药状态,防止自舔及互舔习性(需要单笼饲养、固定措施)等。

皮肤药理实验中常用的实验动物有各品系小鼠、大鼠、豚鼠、金黄地鼠、家兔、微型猪等。它们在免疫、移植、炎症、感染、创伤、肿瘤和皮肤器官本身疾病以及皮肤刺激、过敏、光敏等方面各有专用和选择。其中乳猪在实验动物中与人的皮肤组织结构最相似,已逐渐成为皮肤科外用制剂的药物透皮吸收研究、皮内药物浓度测定,以及生物利用度和生物等效性评估时的较理想的实验动物。皮肤局部用药长期毒性试验的首选动物是突变系微型猪。

人类皮肤疾病动物模型发展较滞后,但可能是最有潜力及发展前景的整体研究手段。按模型制备方式,一般可分成三类:一是实验诱发皮肤病模型,模型复制相对简单,但不能忽视致病原因和发病机制的内在的相关性,其可靠性常是相对的,与自发性动物模型及人类疾病有差异和距离,也不是所有人类疾病都可以用人工方法诱发。二是自发性动物模型,是基于动物染色体基因发生变异和遗传缺陷,形成与人类疾病相似的病变,现已形成皮肤表型的突变株包括:无毛、无皮脂腺、毛囊数减少、皮肤鱼鳞状、粗糙发硬等改变及有系统改变的胸腺皮质萎缩、细胞及体液免疫降低,以及与红斑狼疮、肾小球肾炎相似的自身免疫性小鼠等。这是有科学价值的模型动物,可供特殊研究之用,其缺点是迟发、个体差异大、实验难以控制。三是基因工程动物,又分为转基因、基因定位突变和基因化学或放射诱变三类动物模型。转基因动物将分子、细胞和整体水平的研究有机地联系起来,可以“真实”地体现目的基因的活动特征;基因定位突变(包括基因剔除、插入等技术)是在整体动物水平上研究特定基因功能的最佳方法;基因化学或放射诱变可以导致完全或部分基因功能缺失,以及整个基因组上的任何位置上诱发突变。由此可见,从比较医学和遗传学角度定向研究和培育与人类疾病相似的突变系动物,可以获得众多具有重要价值的动物人类疾病模型。基因工程技术提供了研究人类疾病动物模型的新途径,其优点是准确、经济、试验次数少和大大缩短实验时间,其理论和技术是依赖于人类致病基因的研究进展的基础上。

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