利用唾液作为诊断疾病的样品已有约100年的历史,但早期的应用很不普遍,而且诊断指标的重要性和准确性都不能在诊断学上具有一席之地。近30年来,用唾液诊断疾病、中毒及吸毒等逐渐广泛。尤其是过去10年中,使用唾液作为诊断媒体越来越为人们所接受,对新技术的尝试也逐渐增加,包括DNA微阵列技术、蛋白组学分析、纳米技术等等。然而,大多数分析技术仍然处于探索试验阶段。
使用唾液作为诊断样品的优缺点
唾液含有许多蛋白质及遗传分子,如酶类、激素、抗体及其他抗微生物成分、生长因子。从这个角度来讲,唾液与血清类似,可以反映机体的生理和健康状况。唾液成分的改变常常是由于唾液腺本身功能异常,或影响唾液腺功能的全身性疾病,以及有关生理性改变,因而唾液成分可以反映身体的某些侧面,例如身体中物质合成和代谢水平、治疗使用的药物水平、进人体内的毒物水平、免疫状况、营养状况、代谢状态、激素水平、情绪变化等等。
使用唾液作为诊断性媒体的优点在于取样简便、无痛、无损伤,这是一个很大的优势,特别是当患者或受试者是幼儿或紧张型个体时。但是,使用唾液也存在不少缺点。首先,口腔本身不是清洁环境,其中的微生物可产生多种物质、可对许多物质进行代谢,因而当唾液与口腔接触时,唾液中的成分会发生改变。其次,体内有些物质会在唾液腺细胞内被代谢。唾液腺含有混合功能氧化酶和许多其他酶类,可使许多种类的物质发生改变。第三,体内很多物质与血浆成分结合,只有小部分为游离状态;在正常状态下,进入唾液的部分常常仅为血中游离部分。如果口腔内存在微小的损伤,导致少量血液和血液成分直接进入口腔,则会使该类物质与血浆结合的部分在唾液中的浓度大为增高,从而出现假阳性。第四,口腔的卫生状况可影响唾液pH值,从而影响唾液内物质的检测。因而,广泛使用唾液作为诊断媒体,尚有许多技术上的障碍需要克服。
使用唾液作为诊断样品的技术考虑
使用唾液作为诊断样品的主要困难在于技术方面。一种良好的诊断方法应该具备以下几个特点:高度灵敏、高度特异、高度准确、操作快速简单、可满足实际需要、价格便宜。例如,有些测定不需要化验室,可在被测者家中进行;不需要专业实验人员,可由患者或被检者自己测定;例如唾液HIV抗体的测定。目前,技术方面的困难主要在于唾液中缺乏高度特异的标志物质、缺乏唾液测试项目与疾病的相关性研究、缺乏可用于唾液测定的高度灵敏的技术、有些分子在唾液中的生物节律性变化不明、唾液水平与血清浓度缺乏相关、收集唾液的过程会影响结果、唾液中的有些标志物质浓度太低、唾液分泌速率影响被测物质的浓度。虽然过去10年中在测定技术方面做了很多尝试,取得了很多成果,但仍然是唾液作为诊断测定的瓶颈,技术上的改进将是突破口。
唾液收集技术
如上所述,收集唾液是测定的第一步,它常决定测定的成败。收集唾液的理想方法和装置应该是易操作、不被口腔环境污染。目前,多家公司生产收集唾液的装置,例如,Salimetrics Oral Swabs(www.salimetrics.com)、OraSure Technologies HIV标本收集装置(www.orasure.com)、Oasis Diagnostics®的DNA•SALTM唾液收集装置(www.4saliva.com)、CoZart药物滥用样品收集装置(www.concateno. com)、Greiner Bio-one唾液收集系统(www.gbo.com)。
测定盒
多家公司已经研究生产了多种测定盒,包括用唾液测定多种毒品和易被滥用的药品、酒精、激素以及HIV抗体。这些公司包括Salimetrics,OraSure Technologies,Oasis Diagnostics等。除了研制和生产更多的专业测定盒供应研究室、临床化验室、监测检验室以外,研发更多的使用简易、价格便宜的测定盒,尤其是家庭中非专业人员使用的测定装置,是未来发展的方向。
新技术的研发
过去10年中,唾液测定技术的进步主要体现在唾液蛋白质与核酸的分析方面。用液相色谱与质谱相结合的技术已可从混合唾液中鉴别1050种蛋白质。Schipper等用蛋白组技术分析发现,混合唾液中含有1100种蛋白质,其中650种来自腮腺和下颌下腺、50种来自舌下腺。Denny等发现,混合唾液中有1166种蛋白质,其中914种来自腮腺、917种来自下颌下腺和舌下腺。迄今,不同的实验室发现,唾液中共有2290种蛋白质;大约27%的血浆蛋白存在于唾液中。
常用的测定唾液蛋白质表达的方法是一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。二维PAGE不仅可以分离分子量类似的蛋白分子,而且可以显示修饰不同的蛋白质。与质谱联合使用可以对PAGE分离的蛋白质进行更精确的测定。目前正在尝试的新方法很多,包括电喷射离子化技术、基质协助激光解吸离子化(matrix-assisted laser desorption ionization)、四极/线性离子捕获(quadrupole/linear ion trap)、“飞行时间”(time-of-flight)、四极飞行时间、傅里叶变换离子回旋共振等。然而,这些方法技术目前仅限于实验室使用,转化为快速的化验室外测定技术尚需时日。目前最新发展的芯片实验室(lab on a chip)具有同时测定多种生物标志的潜力,可能会为大样本筛测某些疾病带来便利。
使用微矩阵法测定疾病的标志生物分子也在尝试中,但仍有不少技术难关需要攻克。比如,唾液的RNA多为片段,没有聚腺苷酸尾,不能避免降解。最近已有一种新型、不依赖3'-聚核苷酸的扩增技术可以恢复唾液RNA片段,并已制成测定盒,可用Affymetrix外显子矩阵技术平台分析所有的片段,为研究唾液腺转录组(transcriptome)提供了方法。
根据10年来唾液分析技术的进展,有人认为,尽管成熟、简便、费用低的唾液分析方法仍处于试验阶段,但在不久的将来,唾液测定会成为临床诊断的一种主要的诊断手段。