血清抑制素B检测:原理、试剂操作

抑制素B(Inhibin B)是由睾丸Sertoil细胞分泌的二聚体糖蛋白激素,由两个亚单位共价连接而成,参与下丘脑-垂体-性腺轴的反馈调节。INH B作为转化生长因子β超家族的一员,是男性性腺的一个重要局部调节因子,在精子发生过程中发挥作用,其水平与精子发生或损害有良好的相关性,直接反映睾丸功能和生精上皮状态,被认为是评价精子发生最佳的内分泌标志物。近年来,抑制素B在男性生殖功能中的作用逐渐被人们认识,其在男性不育诊断和辅助生殖领域也得到了广泛的应用。血清抑制素B检测目前主要采用ELISA法,本节主要介绍此分析方法。

参考值:正常男性:164.32±77.21pg/ml(周慧等,中国妇幼保健,2009,Vol.24,No.28:3987),由于产品不同及各地区实验室的差异,实验室可建立自己的参考值。

基本原理

采用双抗体夹心免疫测定法。在实验中,标准品、质控品及待测血清样本都在包被有抗抑制素bB亚单位抗体的微孔板中孵育。孵育及洗板之后,所有孔都加入生物素标记的抗抑制素a亚单位的检测抗体。再孵育及洗板之后,所有孔加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物。第三次孵育及洗板之后,加入TMB底物孵育。之后加入终止液,最后用双波长在450nm及620nm处测吸光度。测得的吸光度与抑制素B的浓度成正比。标准品用于描绘吸光度的标准曲线,待测抑制素B的浓度可从此曲线中读出。

试剂

  1. 微孔板:包被有抗抑制素bB亚单位抗体的微孔板96孔;
  2. 标准品A:2ml×1瓶,胎牛血清,含0pg/ml二聚体抑制素B;
  3. 标准品B-G:1.0ml×6瓶,胎牛血清,含二聚体抑制素B的浓度为10,30,100,250,500,1000pg/ml;
  4. 质控品(Ⅰ和Ⅱ):1.0ml×1瓶;
  5. 抑制素B抗体生物素复合物:10ml×1瓶;
  6. 酶结合物:10ml×1瓶,含链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物;
  7. 样本缓冲液A:10ml×1瓶;
  8. 样本缓冲液B:10ml×1瓶;
  9. TMB底物液:11ml×1瓶;
  10. 终止液:11ml×1瓶,为0.2M的硫酸;
  11. 浓缩洗液:100ml×1瓶。

操作

  1. 标记待用的微孔板条;
  2. 分别吸入50ul标准品、质控品和样本加入相应的微孔中;
  3. 每孔加入25ul样本缓冲液A;
  4. 每孔加入25ul样本缓冲液B;
  5. 置于摇床(300~400rmp)中,于室温(-25℃)孵育过夜(14~18h);
  6. 用全自动洗板机再清洗6次(或甩尽孔内液体,每孔加350ul去离子水,重复5次操作),倒置吸水纸上拍干;
  7. 每孔加入50ul抑制素B抗体生物素复合物;
  8. 加盖置于摇床(500~700rmp)中,于室温(-25℃)孵育1.5h;
  9. 用全自动洗板机清洗6次(或甩尽孔内液体,每孔加350ul去离子水,重复5次操作),倒置吸水纸上拍干;
  10. 每孔加入50ul链球菌抗生物素蛋白酶联物;
  11. 加盖置于摇床(500~700rmp)中,于室温(-25℃)孵育20min;
  12. 用全自动洗板机清洗6次(或甩尽孔内液体,每孔加350ul去离子水,重复5次操作)。最后一次冲洗后,用冲洗液浸泡孔15min;
  13. 用全自动洗板机清洗6次(或甩尽孔内液体,每孔加350ul去离子水,重复5次操作),倒置吸水纸上拍干;
  14. 每孔加入100ulTMB底物液;
  15. 置于摇床(500~700rmp)中,于室温(-25℃)避光孵育15~30min;
  16. 每孔加入100ul终止液;
  17. 在30min内用酶标读数仪读数。

注意事项

  1. 血清在2~8℃可保存24h,-20℃以下可保存30d。样本应避免反复冻融,不要用溶血或者高脂血症的样本,冰冻样本应解融并混匀后再用;
  2. 试剂保存于2~8℃冰箱内,有效期内使用,不要混用不同产品的试剂;
  3. 质控品、标准品开瓶后2~8℃可保存2周,-20℃以下可保存至有效期;
  4. 酶联复合物、TMB底物等试剂应避光保存,避免金属和细菌污染;
  5. 所有试剂和样本在使用前应平衡至室温(25℃)并轻轻地摇匀;
  6. 实验室的温度最好设置在25℃,过低将影响反应程度。

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