血清抑制素B检测：原理、试剂操作

抑制素B（Inhibin B）是由睾丸Sertoil细胞分泌的二聚体糖蛋白激素，由两个亚单位共价连接而成，参与下丘脑-垂体-性腺轴的反馈调节。INH B作为转化生长因子β超家族的一员，是男性性腺的一个重要局部调节因子，在精子发生过程中发挥作用，其水平与精子发生或损害有良好的相关性，直接反映睾丸功能和生精上皮状态，被认为是评价精子发生最佳的内分泌标志物。近年来，抑制素B在男性生殖功能中的作用逐渐被人们认识，其在男性不育诊断和辅助生殖领域也得到了广泛的应用。血清抑制素B检测目前主要采用ELISA法，本节主要介绍此分析方法。

参考值：正常男性：164.32±77.21pg/ml（周慧等，中国妇幼保健，2009，Vol.24，No.28：3987），由于产品不同及各地区实验室的差异，实验室可建立自己的参考值。

基本原理

采用双抗体夹心免疫测定法。在实验中，标准品、质控品及待测血清样本都在包被有抗抑制素b_B亚单位抗体的微孔板中孵育。孵育及洗板之后，所有孔都加入生物素标记的抗抑制素a亚单位的检测抗体。再孵育及洗板之后，所有孔加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物。第三次孵育及洗板之后，加入TMB底物孵育。之后加入终止液，最后用双波长在450nm及620nm处测吸光度。测得的吸光度与抑制素B的浓度成正比。标准品用于描绘吸光度的标准曲线，待测抑制素B的浓度可从此曲线中读出。

试剂

1. 微孔板：包被有抗抑制素b_B亚单位抗体的微孔板96孔；
2. 标准品A：2ml×1瓶，胎牛血清，含0pg/ml二聚体抑制素B；
3. 标准品B-G：1.0ml×6瓶，胎牛血清，含二聚体抑制素B的浓度为10，30，100，250，500，1000pg/ml；
4. 质控品（Ⅰ和Ⅱ）：1.0ml×1瓶；
5. 抑制素B抗体生物素复合物：10ml×1瓶；
6. 酶结合物：10ml×1瓶，含链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物；
7. 样本缓冲液A：10ml×1瓶；
8. 样本缓冲液B：10ml×1瓶；
9. TMB底物液：11ml×1瓶；
10. 终止液：11ml×1瓶，为0.2M的硫酸；
11. 浓缩洗液：100ml×1瓶。

操作

1. 标记待用的微孔板条；
2. 分别吸入50ul标准品、质控品和样本加入相应的微孔中；
3. 每孔加入25ul样本缓冲液A；
4. 每孔加入25ul样本缓冲液B；
5. 置于摇床（300～400rmp）中，于室温（-25℃）孵育过夜（14～18h）；
6. 用全自动洗板机再清洗6次（或甩尽孔内液体，每孔加350ul去离子水，重复5次操作），倒置吸水纸上拍干；
7. 每孔加入50ul抑制素B抗体生物素复合物；
8. 加盖置于摇床（500～700rmp）中，于室温（-25℃）孵育1.5h；
9. 用全自动洗板机清洗6次（或甩尽孔内液体，每孔加350ul去离子水，重复5次操作），倒置吸水纸上拍干；
10. 每孔加入50ul链球菌抗生物素蛋白酶联物；
11. 加盖置于摇床（500～700rmp）中，于室温（-25℃）孵育20min；
12. 用全自动洗板机清洗6次（或甩尽孔内液体，每孔加350ul去离子水，重复5次操作）。最后一次冲洗后，用冲洗液浸泡孔15min；
13. 用全自动洗板机清洗6次（或甩尽孔内液体，每孔加350ul去离子水，重复5次操作），倒置吸水纸上拍干；
14. 每孔加入100ulTMB底物液；
15. 置于摇床（500～700rmp）中，于室温（-25℃）避光孵育15～30min；
16. 每孔加入100ul终止液；
17. 在30min内用酶标读数仪读数。

注意事项

1. 血清在2～8℃可保存24h，-20℃以下可保存30d。样本应避免反复冻融，不要用溶血或者高脂血症的样本，冰冻样本应解融并混匀后再用；
2. 试剂保存于2～8℃冰箱内，有效期内使用，不要混用不同产品的试剂；
3. 质控品、标准品开瓶后2～8℃可保存2周，-20℃以下可保存至有效期；
4. 酶联复合物、TMB底物等试剂应避光保存，避免金属和细菌污染；
5. 所有试剂和样本在使用前应平衡至室温（25℃）并轻轻地摇匀；
6. 实验室的温度最好设置在25℃，过低将影响反应程度。