己糖激酶法是测定血糖的参考方法,测试灵敏度和重复性好,特异性高,对标本存在着轻度溶血、脂血、黄疸时不影响测定结果。维生素C、氟化钠、肝素、EDTA和草酸盐等,也不干扰本法测定。
测定原理
葡萄糖在三磷腺苷二钠(ATP)存在下,由己糖激酶(HK)催化作用,生成葡萄糖-6-磷酸和二磷酸腺苷二钠(ADP),前者在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)催化下脱氢,生成6-磷酸葡萄糖酸(6-GP)。同时使NADP变成NADPH。反应式如下:
根据反应方程式NADPH的生成速率与葡萄糖的浓度呈正比,在波长340nm监测其吸光度生成速率,计算血清中葡萄糖含量。
试剂
试剂Ⅰ:
- 200mmol/L:2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇缓冲液(pH 7. 0)
- 4mmol/L:醋酸镁
- 3.5U/ml:己糖激酶
- 5.3U/ml:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
- 3.5mmol/L:NADP
试剂Ⅱ:
- 200mmol/L:2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇缓冲液(pH 9. 0)
- 2mmol/L:三磷腺苷二钠,若用半自动分析仪检测,可根据试剂盒说明书,将试剂按一定比例混匀,置棕色瓶中,放冰箱保存,约可稳定7天。双试剂可直接用于全自动生化仪检测。
- 5mmol/L葡萄糖标准应用液:见GOD法。
操作
速率法测定(以半自动分析仪为例),主要参数、系数:8. 2、孵育时间:30s、监测时间:60s、波长:340nm、比色杯光径:1. 0cm、吸样量:0. 5ml、温度:37℃。
1)加样:37℃预温酶混合试剂1000μl,加血清20μl,立即吸入自动生化分析仪,监测吸光度升高速率(△A/min)。
2)计算
终点法测定
1)操作:取16mm×100mm的试管,按表下表操作。表中各管充分混匀,在37℃水浴,准确放置10分钟,分光光度计波长340nm,比色杯光径1. 0cm,用蒸馏水调零,分别读取各管吸光度(AU、AC、AS、AB)。
己糖激酶法操作步骤
2)计算
血清葡萄糖(mmol/L)=
血清葡萄糖(mg/dl)=葡萄糖(mmol/L)×18
参考区间:健康成年人,空腹血清葡萄糖为3. 9~6. 1mmol/L(70~110mg/L)。
附注
己糖激酶方法的特异性比葡萄糖氧化酶法高,被认为是测定血清葡萄糖的参考方法,适用于自动分析仪。轻度溶血、脂血、黄疸、维生素C、氟化钠、肝素、EDTA和草酸盐等不干扰本法测定。溶血标本,若血红蛋白超过5g/L,是因从红细胞释放较多的有机磷酸酯和一些酶,干扰本法测定。
虽然根据NADPH的摩尔吸光度可以直接计算血清葡萄糖浓度(如Boehringer、Roche等试剂盒),但建议最好同时测定标准管和空白管(蒸馏水代替血清)。此时计算公式应为: