胰岛相关自身抗体的测定方法

胰岛相关自身抗体的测定方法主要是酶联免疫法,放射免疫法和间接荧光免疫法。新方法也日益多见,如:酶联免疫斑点试验(Elispot)、MHC四聚体(tetramer)、细胞增殖试验、免疫印迹检测、特异性的细胞检测技术及胰岛显像等。这些检查多数为定性实验,少数为定量实验,但目前检测的批间差异相对较大。

酶联免疫法(ELISA)

常用间接法。其原理为利用酶标记的抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。操作基本步骤如下:

  1. 将特异性抗原如与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
  2. 加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原-抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成分在洗涤过程中被洗去。
  3. 加酶标抗体。可用酶标抗人Ig抗体(二抗)。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量呈正相关。
  4. 加底物显色。
  5. 在分光光度仪上测定吸收度。
  6. 结果判断 标准品吸收度应介于阴阳性质控之间,否则实验失败。样品与标准切点对照品的吸收度比较,超过1. 05者为阳性,未超过0. 95者为阴性,介于中间者为可疑。

间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体建立检测相应抗体的方法,但包被抗原时易使抗原的空间构型破坏,灵敏度降低。

放射免疫法(RIA)

利用放射性核素的可探测性、精确性与免疫反应相结合的测定技术。标记已知抗原,使之与患者血清内相应的抗体结合。用抗人免疫球蛋白抗体(二抗)及沉淀剂分离结合抗原与未结合标记抗原。离心,弃上清液,测定沉淀物的放射性计数。计算结合率。通过同时测定的标准品反应曲线计算样本抗体浓度。

放射免疫法具有较高的灵敏性和准确性,但因有少量放射性,对实验人员、条件及废物处理有一定要求。另外,开展此类实验须得到有关部门(卫生、环保、公安)的许可和监管。

间接免疫荧光法

该法属免疫组织化学测定技术,在胰岛相关抗体检测中主要用于ICA的检测。批间差异较大。因为需要O型血人的胰腺,而且需要荧光显微镜,并且操作相对烦琐,所以常规开展有一定难度。

第一步,将人胰腺组织切成薄片,放在载玻片上,加待检血清,在湿盒中37℃保温30分钟,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的抗体。第二步,加上荧光标记的抗球蛋白抗体。如果患者血清中含有ICA,则会发生抗原抗体反应,标记的荧光抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合,从而使切片上胰岛着荧光,在荧光显微镜下观察荧光的有无及其强度,与阳性标本对照,判断结果,结果以JDF单位(juvenile diabetes foundation unit)表示。基本操作如下:

  1. 滴加0. 01mol/L pH 7. 4的PBS于胰腺切片上,10分钟后弃去,使标本片保持一定湿度。
  2. 滴加以0. 01mol/L pH 7. 4的PBS适当稀释的待检血清,覆盖胰腺切片。将载玻片置于有盖搪瓷盒内,37℃保温30分钟。
  3. 取出玻片,置于玻片架上,先用0. 01mol/L pH 7. 4的PBS冲洗1~2次,然后按顺序在0. 01mol/L pH 7. 4的PBS三缸浸泡,每缸5分钟,不时振荡。
  4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
  5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温30分钟。
  6. 重复操作3。
  7. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,滴加一滴缓冲甘油,再覆以盖玻片。
  8. 荧光显微镜高倍视野下观察。

注意事项:荧光染色后一般在1小时内完成观察,或于4℃保存4小时,时间过长,会使荧光减弱。每次试验时,需设置以下三种对照:

  1. 阳性对照:阳性血清+荧光标记物。
  2. 阴性对照:阴性血清+荧光标记物。
  3. 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物。

切片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。

酶联免疫斑点试验(dot-ELISA)

基本原理与ELISA相同,特点:以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体,底物经酶反应后形成有色沉淀,使固相膜染色。通过颜色定性。

其他检测技术:如MHC四聚体(tetramer)、细胞增殖试验、免疫印迹检测、特异性的细胞检测技术及胰岛显像。这些试验方法正在研究和试用阶段。(李铭)

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