精子DNA损伤检查:SCSA、彗星实验

常规的精液分析能够从精子浓度、精子活力和精子形态等方面反映精液质量,但是其在评价精子功能方面的价值有限,不能直接反映精子受精能力和对胚胎发育的影响。近年来的研究表明精子DNA的完整性与精子活力、精子形态及精子功能有显著相关性,并且可以影响受精卵的分裂以及胚胎的发育。精子DNA是遗传信息的载体,精子DNA的完整性对种族的繁衍具有重要意义,但是精子生成过程中染色质的浓缩异常、受损精原细胞的凋亡异常、环境毒物以及不良的生活习惯都会造成精子DNA损伤。因此,精子DNA损伤的检测越来越受到重视。

精子DNA损伤的检测方法有很多,如彗星实验(COMET assay)、精子染色质扩散实验(sperm chromatin dispersion test,SCD)、末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)以及吖啶橙(AO)荧光染色法。其中AO荧光染色结合流式细胞术的检测方法,即染色质结构分析法(sperm chromatin structure assay,SCSA)是检测精子DNA断裂指数(DNA fragmentation index,DFI)的一种更快捷、准确、直观的方法。采用流式细胞仪对经AO荧光染色的精子进行分析,数秒内就能高速检测数万个精子,检测结果客观可信,重复性高。目前已经广泛应用于临床。SCSA除了能检测精子DNA损伤程度,还能给出受检标本中不成熟精子的百分率,提高了结果的可应用性。本节主要介绍精子染色质结构分析法(sperm chromatinstructure assay,SCSA)和彗星实验。

SCSA

SCSA原理是通过AO荧光染料对精子染色质进行染色,从而评估单链DNA和双链DNA的比例(酸性环境会使双链DNA解链)。精子染色体完整性的破坏可以通过流式细胞仪检测荧光显色由绿色(正常的,双链DNA)和红色荧光(受损的,单链DNA)来评估,并且以绿色荧光和红色荧光的比值来显示评估的结果,用精子DNA断裂指数(DFI)来表示精子DNA损伤程度,他表示红色荧光与全部检测到的绿色及红色荧光之和的比值。

试剂与配制

  1. TNE缓冲液(200ml)配制:准确称取NaCl 1.75g,Tris-Base 2.42g,Na2EDTA.2H2O 0.074g,溶于150ml超纯水中,调节pH值为7.4,再用量筒定容到200ml。该溶液各组分终浓度分别为0.15mol/L NaCl、0.01mol/L Tris-HCl、1mmol/L Na2EDTA。
  2. 酸变性液(400ml)配制:准确称取NaCl 3.51g,溶于300ml超纯水中,加入1mol/L HCl 32ml及Triton X-100 400μl,震荡混匀,调节pH值为1.2,再用量筒定容到400ml。该溶液各组分终浓度分别为0.08mol/L HCl、0.15mol/L NaCl、0.1%Triton X-100。
  3. AO染色液(1000ml)配制:准确称取柠檬酸7.11g,Na2HPO4.12H2O 45.13g,Na2EDTA.2H2O 0.41g,NaCl 8.77g,AO 6mg,溶于800ml超纯水中,震荡混匀,调节pH值为6.0,再用量筒定容到1000ml。该溶液各组分终浓度分别为0.037mol/L柠檬酸、0.126mol/L Na2HPO4、0.0011mol/L Na2EDTA、0.15mol/L NaCl、6μg/ml AO。
  4. 标记试剂名称和配制日期,以上试剂均置4℃保存。

操作过程

  1. 精液标本液化后存放于-70℃或液氮中;
  2. 根据精子浓度取一定量精液,与200μl TNE缓冲液(4℃存放)混合,使精子浓度为1~2×106/ml;
  3. 立即加入400μl酸变性液(4℃)并混合;
  4. 30s后加入1.2ml AO染色液(4℃),上流式检测(流速应少于300精子/s);
  5. 保存检测文件,用分析软件分析DFI。

彗星实验

彗星实验原理:正常精子DNA以大量超螺旋的组织形式存在,当DNA受到氧化损伤发生断裂后,受损部分的DNA可在凝胶电泳时伸展开来。将受损的精子在琼脂糖凝胶上裂解并电泳,在pH9.5条件下,分离的DNA条带出现。精子DNA用荧光染料标记后,荧光显微镜下可呈现具有头尾的“彗星”形状。随着精子DNA受损的加剧,将会有更多物质从“彗星”头部移出。通过测定“彗星”头、尾的相对荧光强度,可对精子DNA损伤程度进行定量。

试剂与配制

  1. 琼脂糖;
  2. PBS缓冲液;
  3. 0.75%低融点琼脂糖,以PBS缓冲液配制,于37℃恒温水浴箱中保温;
  4. 裂解液:含2.5mol/L NaCl、100mmol/L EDTA、10mmol/L Tris、1%Triton X-100,用NaOH调节pH10.0;
  5. TAE缓冲液:40mmol/L tris-acetate、1mmol/L EDTA,pH8.0;
  6. 0.3mol/L NaOH;
  7. 0.4mol/L Tris-HCl,pH8.0;
  8. 2μgl/ml吖啶橙;
  9. 碱性电泳缓冲液:含0.27mol/L NaCl、1mmol/L EDTA的0.03mol/L NaOH溶液。

操作过程

  1. 将待测细胞用冰预冷的PBS缓冲液洗3次,最后用PBS制成浓度为1×105/ml的悬液,置于冰上待检。
  2. 在显微镜载玻片上均匀铺上一层琼脂糖(500μl 0.3%的琼脂糖,以PBS缓冲液配制),注意表面平整,置于室温空气中晾干。
  3. 向15μl细胞悬液中加入150μl 0.75%低溶点琼脂糖。
  4. 混匀后,立即吸取15μl悬液滴加于预处理过的载玻片上,盖上盖玻片,放在一个金属盘中置于冰上(0℃)。
  5. 当凝胶凝固后,小心移去盖玻片。
  6. 把载玻片浸入冰冷的裂解液中,4℃放置1h。
  7. 将载玻片取出,用TAE缓冲液洗涤脱盐。
  8. 再将载玻片浸入0.3mol/L NaOH溶液中保持20min。
  9. 已含0.27mol/L NaCl的0.03mol/L NaOH为电泳缓冲液,将载玻片置于电泳仪上电泳,调节电流为30mA。
  10. 将载玻片取出,浸入0.4mol/L Tris-HCl(pH8.0)以中和强碱。
  11. 用双蒸水洗涤载玻片,晾干后用甲醇固定。
  12. 将载玻片浸入吖啶橙溶液中染色后,于荧光显微镜下观察结果(Ex390-490、Em525),并摄影、分析。

结果分析

借助于专用图像分析设备,由“彗星”电泳图像可获得许多参数,可以反映细胞DNA损伤的程度,常用的分析参数包括:

  1. 距“彗星”头部中心一定距离(n)处区域的平均荧光强度(Fn)与头部核心区荧光强度(Fo)的比值。
  2. “彗星”尾部或整体的长度。
  3. “彗星”尾部长度(头部边缘至尾端距离)与头部直径的比值。
  4. “彗星”头、尾或整体于凝胶上的电泳迁移率。

注意事项

  1. 此法中的电泳可采用不同的电泳缓冲液,然而彗星的形状根据所用的电泳条件的不同而异。若采用中性电泳缓冲液,则彗星的尾部较紧凑,用碱性的电泳缓冲液,尾部较为松散。
  2. 中性电泳缓冲液下的电泳形成的彗星,其尾部在结构上于头部DNA紧密连接。若电泳前预先用碱处理样品使DNA解旋,可增加彗星拖尾的长度,提高检测的灵敏度,这时的彗星尾部中含有一些DNA断裂片段。
  3. 本法用荧光染色的方法显示彗星,另外也可以预先用(14C)胸腺嘧啶掺入法标记细胞DNA,然后再接受损伤因素的处理,这样可以用放射自显影的方法检测电泳形成的彗星。
  4. 方法中的吖啶橙也可以用其他DNA染料代替,如10μg/ml溴化乙锭(ED)、2.5×10-5 mol/L PI (propidium iodide)
  5. 试验中所用的PBS应防止Ca2+、Mg2+的污染,保证以PBS配制的琼脂糖凝胶体系中不含这两种离子。为了抑制核酸酶的活性,防止由DNA酶降解损伤而导致实验误差。在电泳缓冲液中加入一定浓度的EDTA也是为了清除Ca2+、Mg2+等离子。

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