成熟卵母细胞的收集

成熟卵母细胞(mature oocyte)的收集,是人类IVF成功的基本前提。世界第一例试管婴儿是在自然周期条件下,获取一个成熟卵母细胞进行体外受精-胚胎移植的。1980年澳大利亚Monash大学Trounson博士将克罗米芬用于刺激卵泡的发育,以获取更多的卵母细胞提高IVF-ET的临床妊娠率。自此以后,控制性的超排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)技术得到了全世界同行的认可和推广,IVF-ET的成功率也得到了明显的提高。时至今日,应用于COH的药物得到了很大的发展,COH方案也针对患者的不同情况而多样化。

刺激卵泡生长的方法

自然周期卵泡的成熟

世界第一例试管婴儿取卵的时间是选在自发排卵前,但只能取到单个的卵细胞。这使Edwards等人认为人工排卵周期对成功的IVF是必需的。人类自发性排卵的时间可通过一些方法,如血浆LH、雌激素和超声图像来预测。

1.LH峰出现的时间有每天的规律,通常在上午5:00~10:00较之其他时间发生的机会要多得多。

2.血浆雌激素浓度在LH峰出现之前32h升高,雌激素上升的坡度平行于LH峰。

3.超声图像研究表明,在自发排卵期约排卵前5d卵泡的大小几乎是逐天增加,从12mm到23mm,雌激素与卵泡直径之间呈线性关系。

自然周期IVF仅需要简单监测卵泡,在自发LH峰之前获取单个卵母细胞。因此,多胎妊娠以及卵巢过度刺激综合征的风险也大大降低。但是自然周期IVF的缺点显而易见,提早出现LH峰、过早排卵导致出现较高的周期取消率,起始周期的平均ET率为45.5%,移植周期的平均临床妊娠率为15.8%。每启动周期妊娠率仅有7.2%。对此人们进行了诸多探索。

改良自然周期保留了自然周期优点的同时也提高了妊娠率。在改良的自然周期中,在卵泡晚期应用促性腺激素释放激素(GnRH)拮抗剂抑制提早出现的LH峰。使用外源性促性腺激素(Gn)维持优势卵泡的持续生长。目前大多数改良的自然周期在卵泡直径为12~17mm时使用GnRH拮抗剂以及Gn。绝大部分采用改良自然周期的患者是由于对常规方案反应差,因此改良的自然周期IVF有可能提高部分特殊患者的IVF成功率。Pelinck等对350例年龄<35岁患者进行844个改良的自然周期,每个周期妊娠率为8.3%,3个周期之后的累计继续妊娠率达到20.8%。与自然周期20%的取消率相比,改良的自然周期因提早出现LH峰导致周期取消率为13%。

一般认为年龄<35岁,有正常的月经周期,内分泌正常,有正常的宫腔环境,卵泡发育正常,可以选择自然周期IVF。研究认为自然周期IVF较适合输卵管因素、卵巢反应不良、轻度盆腔子宫内膜异位症的不孕症患者,不明原因性不孕症自然周期IVF的临床妊娠率偏低。对于年轻的有规律月经周期的女性,尤其是有卵巢肿瘤史等应用促排卵药物有禁忌证的患者,自然周期IVF是一种可行的选择。

使用克罗米芬和hMG刺激卵泡生长

IVF最初阶段多半使用单纯的克罗米芬来刺激卵巢,诱发超排卵,因为他相对经济且用药方便。克罗米芬是最常用的诱发排卵药物,是三茴香基乙烯类似物,他与17β-雌二醇受体的位点结合,干扰雌二醇对下丘脑和腺垂体轴的负反馈效应,增加促性腺激素的分泌,引起多个卵泡发育。克罗米芬从体内清除速度较慢,口服剂量的克罗米芬5d内仅清除50%,用放射性同位素标记克罗米芬,发现用药6周后仍有克罗米芬排出,引起人们对克罗米芬的关注,特别是他对子宫内膜的抗雌激素作用可能逆转子宫对着床的可接受性效应。克罗米芬的主要作用部位在下丘脑和腺垂体。与单独使用绝经期促性腺激素(hMG)相比较,克罗米芬能够使较多卵泡同步生长发育。由于他的这一作用有人采用克罗米芬使用后紧接着给予hMG这一治疗方案,并在IVF的卵巢刺激促排卵中收到较好的效果。hMG能够使经克罗米芬诱发的多个卵泡继续发育和成熟。将这些从卵巢取出的卵母细胞用酶解的方法去除卵丘细胞,发现大多数卵母细胞的核成熟并且第一极体排出,如改用单独hMG刺激卵巢,很难见到上述现象。后来出现许多种刺激卵泡发育和排卵的方案,但大多都基于克罗米芬与hMG的联合应用或单独使用hMG,现在除了使用hMG诱发多卵发育外,还包括使用纯化的FSH。然而,应用CC/hMG/hCG或者hMG/hCG进行促排卵时,多个卵泡发育引起的内源性LH峰的提早出现,影响卵子的质量,导致的周期取消率约为20%。因此,在相当长一段时间内此方案基本不用于临床IVF。

近年来对于高龄或卵巢低反应者,有学者提出应用卵巢微刺激方案进行促排卵,即寻求一种接近自然,不用降调节,而使用克罗米芬或来曲唑结合低剂量促性腺激素的方案。虽然提高促Gn的剂量可能获得较多的卵子和较高的妊娠率,但是大多数文献已经证实,对卵巢反应不良的患者,加大Gn的剂量并不能显著增加卵泡的数目、改善卵子的质量和提高妊娠率,同时还面临大量药物刺激带来的不良反应和昂贵的费用。因此对此类患者,增加Gn的药量不是一个可以接受的方案成为一种共识。微刺激的促排卵方案渐渐获得许多医生的青睐。

观察发现,对利用克罗米芬刺激垂体产生的Gn反馈性分泌,卵巢低反应的女性似乎更加敏感。由大剂量Gn刺激生长的卵泡数可能与克罗米芬50~100mg用3~5d产生的卵泡数大致相等,克罗米芬周期的卵子质量和妊娠率有所提高。这种悬殊的性能/价格的结果,使克罗米芬刺激周期的使用日益广泛。克罗米芬方案在IVF周期中不能有效控制内源性LH分泌的缺点也是显而易见的,但好在由于Gn拮抗剂的临床普及应用,在克罗米芬周期可采用固定或灵活的GnRH拮抗剂方案,在周期第5d或优势卵泡大于12~14mm直径时,拮抗剂每天2.5mg注射,临床医生不用再担心卵子的提前释放,克服了克罗米芬周期没有降调控制排卵的缺点。

同时对卵巢低反应患者妊娠率低和取消率高的特点,接受IVF的治疗周期数可能相对较多,即患者可能接受3~6次IVF周期的卵巢刺激、取卵和移植,克罗米芬方案因为刺激轻微,卵泡数少,对患者的损伤轻微,因此周期的可重复性较高,患者的依从性也较好。即使取消周期,患者的损失也很有限。对克罗米芬抵抗的患者也可以试行芳香化酶抑制剂(来曲唑)取代。如果治疗过程中发现患者内膜薄,可将胚胎冻存,亦可获得一定的累积妊娠率。

目前常用的诱发排卵的方案

1984年,Porter等首次报道了促性腺激素释放激素激动剂(GnRHα)用于IVF-ET控制性排卵的过程,使排卵用药方案发生了重大的变革。而根据GnRHα的生物学作用特点,衍生出长方案、短方案以及超长方案、超短方案,适用于不同的情况。长方案用于抑制垂体的功能,而短方案及超短方案利用其激发Gn的作用。从20世纪90年代开始,长方案已经被临床医生广泛接受并成为常规方案。

一、长方案

GnRHα从月经周期的黄体期开始应用,例如达必佳0.1mg/d或0.05mg/d,14~21d后开始用Gn(FSH/hMG)促排卵,两者一直用到注射hCG时停止。

长方案可有效地防止内源性LH峰的过早出现,防止卵泡过早黄素化,而且能改善卵泡生长发育的同步性,尽可能获得更多的成熟卵泡,有助于提高卵子的质量及妊娠率。然而,长方案可能引起垂体功能的过度抑制,因此Gn用药时间延长,用药量增加,甚至出现卵巢过度刺激综合征;而随后垂体功能短期内难以恢复,从而黄体功能不全,要求IVF-ET后的黄体期支持,这些情况都增加了患者的医疗费用和经济负担。Dor等对CC+hMG+hCG、hMG+hCG和GnRHα+hMG+hCG三种超排卵方法进行了比较,从取卵数,受精卵数和卵裂数三方面看,GnRHα+hMG+hCG取卵方案最佳,其次是hMG+hCG,从卵子成熟比较也是GnRHα+hMG+hCG优于上述两种方案。之所以GnRHα+hMG+hCG获取卵子质量最佳,可能是因为GnRHα抑制体内LH峰的形成,防止卵泡过早黄素化,使多个卵泡在外源性促性腺激素的作用下进行同步发育。

二、超长方案

适用于重度PCOS、高LH及子宫内膜异位症的患者。月经周期第一天开始长效GnRHα,第28天视患者情况加用第二支GnRHα,直到达到完全的降调节,即FSH<5IU/L,LH<5IU/ L,E2<20pg/ml,子宫内膜<4mm。然后同时给予短效的GnRHα和Gn进行超排卵。

三、短方案

适用于35岁以上或卵巢储备功能较差的患者。月经周期第2d开始注射GnRHα 0.1mg/d,第3~4d注射FSH/hMG直到hCG应用时。有学者认为短方案的临床妊娠率不理想。

四、超短方案

适用于卵巢反应不良的患者。月经周期第2d开始注射GnRHα0.1mg/d,用3d后停药;月经周期第3~4d注射FSH/hMG至hCG应用时。有研究认为超短方案的临床妊娠率不理想。

五、hCG促排卵作用

使用hCG控制获取卵泡的时间已被IVF临床普遍接受。给予hCG的时间可依据B型超声波对卵泡大小测定后的结果来确定。当优势卵泡的直径大于1.8cm时,或血浆中雌激素的水平持续上升后的第6d即开始使用。更为复杂的标准是根据内源性LH峰、宫颈黏液的变化、阴道细胞指数、血浆雌激素浓度平台和血浆孕激素上升水平等多种因素来进行判断。

获取卵泡的方法

尽管腹腔镜是一种安全有效的取卵方法,然而很快被后来采用的B型超声仪监测下阴道穿刺取卵方法所取代。采用B型超声仪取卵较腹腔镜取卵法有许多优点:

  1. 只需使用局部麻醉即可操作;
  2. 不造成气腹,还可避免卵细胞有可能暴露在酸性pH环境中;
  3. 降低IVF整个过程中的部分费用,不让患者过分紧张和焦虑。

取卵必备器械主要包括B型超声波仪,配有阴道探头,穿刺导向管,穿刺针(长度31cm,内径15G),无菌洁净试管,负压吸引器。患者在注射hCG后36h,排空膀胱,于正式取卵前30min注射哌替啶75mg,取膀胱截石位,外阴用无菌生理盐水反复冲洗直至干净。所有准备就绪后,在B超监测下,经阴道后穹隆穿刺取卵。在取卵时要注意以下几点:

  1. 弄清楚子宫和卵巢的位置以及两侧卵巢的卵泡数及卵泡的直径大小;
  2. 避开血管,尽量不经膀胱和子宫穿刺;
  3. 不要同时穿输卵管积液和卵巢巧克力囊肿,若出现误穿的情况,需要更换穿刺针;
  4. 经阴道侧后穹隆带负压进针,穿刺线由近及远;
  5. 先明确针尖的位置,再进行穿刺操作;
  6. 在进行对侧卵巢穿刺时必须重新进针;
  7. 为获取较高的取卵率可在吸净卵泡液时,稍退针和旋转针头。

卵的识别及培养

快速准确的从穿刺取卵液中找到卵细胞显得十分重要,往往由于卵细胞与卵泡液,血液混在一起,不易分辨。将穿刺取出的卵泡液迅速倒入圆形培养皿中,摇晃几次,使之均匀分布,在解剖显微镜下快速寻找卵细胞,发现一个灰色透明的黏液团块,在正中或偏一侧处可见到一致密点状结构,即卵细胞。卵细胞、透明带和放射冠又被称为卵冠丘复合体(oocyte corona cumulus complexes,OCCCs),将其清洗后转移到干净的培养皿,置于培养箱。可对卵冠丘复合体成熟度进行评估和分级,分级的方法可根据OCCCs的形态学判断卵细胞的成熟度:

  1. Ⅰ级:卵细胞呈深色,放射冠完全没有分散开,卵丘细胞紧密排列在一起,颜色偏深或卵丘细胞团很小。这级的卵子通常为不成熟卵。
  2. Ⅱ级:卵细胞外观颜色变浅,放射冠已呈不同程度的分散,卵丘细胞排列变稀松,颜色变浅。这级的卵子通常为接近成熟的卵子。
  3. Ⅲ级:卵细胞外观颜色很淡,形状为规则的圆形,放射冠呈完全分散状,卵丘细胞团通常较大,排列稀松,颜色很淡。这级的卵子通常为成熟卵。
  4. Ⅳ级:卵细胞颜色变深,放射冠分散,但外周卵丘细胞很小或缺失。这级的卵子通常为过熟的卵子。

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