精子冷冻保护剂

研究表明,未添加冷冻保护剂的精子在冷冻贮存并复温后,仅有0.1%的精子具有一定程度的运动能力。在精子冷冻之前,为了减轻精子冷冻及复温过程中细胞的损伤,获得理想的冷冻复苏率,必须加入一些具有保护作用的物质,这些物质统称冷冻保护剂。作为冷冻保护剂需具备如下两个条件:第一,对被冷冻细胞无毒性或很低毒性;第二,具有高的水溶性,可与水以任何比例混合,确保在冰晶形成初期,稀释细胞外液中溶质的浓度。在冷冻过程中,渗透性保护剂渗入细胞内,替代水分延缓了细胞内水分的减少及由此引起的溶质浓度增加,减轻细胞皱缩的程度,保护细胞顺利通过冰晶形成阶段。

冷冻保护剂分类

根据化学结构分类:醇类、酰胺类、高分子多糖类、单糖类、蛋白质类、无机盐类等。

根据冷冻保护剂的作用机制分类:渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。

渗透性冷冻保护剂

渗透性冷冻保护剂也称膜内保护剂,如甘油、二甲亚砜(DMSO)、丙二醇、甲醇、葡萄糖等,均为小分子化合物。这类保护剂极易通过细胞膜进入到细胞内,降低胞质中溶质浓度,减少进入细胞内电解质的量,减轻冷冻及复温过程中细胞渗透性肿胀,减缓细胞皱缩的程度,有效降低细胞内冰晶形成的温度,阻止或减少冰晶的形成。多数渗透性保护剂是水溶性强的小分子物质。甘油是发现最早,也是迄今为止应用最为广泛的精液冷冻保护剂,他具有高渗透性,可与水以任何比例混合,能起到稳定细胞内电解质的浓度,防止蛋白质变性的作用,同时也可使细胞内冰晶形成的温度显著降低,减少或阻止细胞内冰晶形成。甘油还可以渗入细胞内使细胞内外渗透压平衡,减缓细胞的皱缩程度。甘油在温度低于0℃时扩散进入细胞较为困难,因此,冷冻前,在室温下先将精子与冷冻保护剂平衡10~20min,可起到减少细胞冷冻损伤的效果。

非渗透性冷冻保护剂

非渗透性冷冻保护剂也称膜外保护剂,如果糖、蔗糖、蜂蜜和一些高分子化合物,如聚乙烯吡咯酮、右旋糖酐、卵黄、白蛋白等,这类物质不能穿过精子细胞膜,其作用是通过维持细胞膜的稳定来保护精子。此外,他能够提高细胞外渗透压,在冷冻过程中使细胞内的水分快速向细胞外渗出,减少细胞内水分,从而减少细胞内冰晶形成,保护细胞免遭因冰晶形成而造成的机械损伤。非渗透性保护剂中,白蛋白具有降低精子细胞的氧消耗量、减少活性氧产生的作用。卵黄中的卵磷脂黏附在细胞膜上,可起到稳定精子细胞膜,阻止顶体膜破裂的作用。冷冻精液复温时,由于非渗透性保护剂在细胞外液形成的高渗浓度,可以有效防止水分快速进入细胞引起的肿胀破坏。

冷冻保护剂的配制方法

研究表明,精子冷冻过程中,含卵黄的冷冻保护剂比不含卵黄的冷冻保护剂效果好。现常用的冷冻保护剂均以甘油-卵黄-枸橼酸钠(GEYC)复合剂为基础改良配制而成。通过观察精子冷冻复苏后的超微结构发现,GEYC比单独使用一种成分的保护剂效果好,现将GEYC精子冷冻保护剂及《WHO人类精液检查及处理实验室手册》(第五版)推荐的保护剂配方介绍如下:

GEYC的1∶1配方

GEYC1∶1配方

GEYC1∶1配方

已有与GEYC配方相似商品化的冷冻保护剂,因为冷冻保护剂中添加了青霉素和链霉素之类的抗生素,使用时应注意个别受精者发生过敏反应。

GEYC的1∶2配制

《WHO人类精液检查及处理实验室手册》(第五版)推荐的GEYC冷冻保护剂1∶2的配制方法:

  1. 称量1.5g葡萄糖和1.3g含2个水分子的柠檬酸三钠,加消毒的纯净水至65ml。
  2. 加入15ml甘油完全混匀。
  3. 加入1.3g甘氨酸,等完全溶解后用0.45μm微孔过滤器过滤。
  4. 加入20ml新鲜蛋黄(最好由特定的无病原蛋中获得):清洗鸡蛋,去壳,刺破卵膜,用注射器吸取卵黄(每只鸡蛋可获得约10ml卵黄)。
  5. 所制成的悬浮液置56℃水浴箱中孵育40min,经常搅拌。
  6. 检测溶液中的pH值,如果pH值在6.8~7.2范围之外,这样的溶液是不理想的,应该丢弃重新制备,以防加入了不正确的试剂成分或剂量。
  7. 细菌培养可在这一环节进行,以检测溶液是否无菌。
  8. 精子毒性试验也可以在此环节进行。
  9. 在超净台中将溶液以2ml分装,-70℃保存。
  10. 在3个月之内使用。

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