精子的玻璃化冷冻

玻璃化冷冻是指细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速度,从液相直接固化为完全的玻璃态,并以这种玻璃态在低温下长期贮存的技术。在此过程中,无冰晶的形成,液体由液相转变成一种玻璃状的固体状态,避免了冰晶对细胞的物理化学损伤,可获得较传统冷冻方法更好的冷冻效果。

一、玻璃化冷冻技术的主要影响因素

玻璃化冷冻技术的诸多变量因素,极大地影响精子冷冻效果和冻融后的存活率,这些因素包括:冷冻保护剂的类型和浓度、玻璃化冷冻液的作用温度、精子投入液氮前与保护剂的接触时间、玻璃化冷冻时使用的冷冻工具、精子本身的质量等,其中,冷冻保护剂和冷冻降温速度是影响精子玻璃化冷冻效果的主要因素。

二、玻璃化冷冻原理

将精子置于高浓度保护剂中急速降温,仅高浓度冷冻保护剂在冷冻过程中固化,形成无结构的玻璃态,由于其质点不规则排列,能始终保持精子细胞内外溶液中的水分子和离子分布,使跨膜物质的浓度和渗透压差别不大,从而避免了细胞内冰晶的产生对精子造成的机械性损伤,同时也消除了细胞外因冰晶形成而对精子造成的理化损伤。采用玻璃化冷冻方法,可将精子暴露在0℃左右的时间缩短至几毫秒,提高了冷冻速率,减少了冷冻损伤。

三、冷冻保护剂

玻璃化冷冻所需的高浓度保护剂,其浓度可高达8mol/L,易使精子发生毒性效应和渗透性休克,因此,冷冻保护剂的选择及优化是玻璃化冷冻技术应用的关键。较常用的冷冻保护剂有两种:(1)渗透性保护剂:二甲亚砜、乙二醇(EG)、1,2-丙二醇(PROH)等;(2)非渗透性保护剂:蔗糖、海藻糖、聚蔗糖(Ficoll)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。渗透性保护剂的主要作用是透过细胞膜,取代细胞内蛋白、DNA和其他成分中的水分,使细胞内冰点降低,减少或避免细胞内冰晶的形成;非渗透性保护剂通过渗透效应促进细胞缩水,稳定细胞膜,降低达到玻璃化本身所需的冷冻保护剂用量,减少玻璃化溶液的毒性。

在玻璃化冷冻过程中,要实现玻璃化,途径之一是提高冷冻保护剂的浓度,但冷冻保护剂浓度的提高又会对精子产生较大毒性,因此,将渗透性、非渗透性保护剂合理化使用,可降低单一保护剂的浓度,减少毒性。在玻璃化冷冻保护剂中,对渗透性保护剂的选择,主要是考虑他的毒性和渗透性。乙二醇是目前普遍认同的毒性低、渗透性快的保护剂。一般情况下,玻璃化保护剂中含有渗透性保护剂的浓度大于30%,非渗透性保护剂(如蔗糖)的浓度通常为0.1~1mol/L,例如用15%EG和15%DMSO添加0.6mol/L的蔗糖作为玻璃化冷冻保护剂,冷冻人囊胚,可取得较理想的效果。

四、玻璃化冷冻速率和冷冻载体

提高冷冻速率,迅速通过冰晶形成温度区是实现玻璃化的另一重要途径,-15~-80℃是冷冻样本凝固点温度和玻璃化转变温度之间的区域,在此温度区域内,冰晶产生并迅速增大,以足够快的降温速率通过此阶段,可使液相直接转变为固相,达到玻璃化状态。另外,较高的降温速率能减少精子与高浓度冷冻保护剂接触的时间,降低冷冻保护剂的毒性作用。目前提高降温速度的策略是减少标本体积,增加标本与液氮的作用面积。将冷冻标本与液氮直接、快速接触,可弱化气态氮的热隔绝作用,加快热交换过程,以达到提高冷冻速率的目的。由于玻璃化冷冻需较高的降温速率,而传统的冷冻载体如冻存管、麦管限制了降温速率,因此,目前一般采用开放式冷冻载体,如冷冻环、冷冻薄膜等。运用冷冻环表面张力,精子附在环的表面,直接投入到液氮中,可使降温速率从传统麦管的2500℃/min提高到20 000℃/min,可获得较好的冷冻效果。

五、玻璃化冷冻面临的问题

1.安全性问题:在玻璃化冷冻过程中,由于考虑冷冻速率的问题,大多采用开放性冷冻载体,虽然达到了提高冷冻速率的目的,但精子与液氮直接接触,潜在的微生物污染及精液之间相互污染问题不容忽视。

2.冷冻体积的问题:由于玻璃化冷冻过程中需提高降温速率,故精子冷冻体积受到极大限制,冷冻体积过大,则降温速率达不到玻璃化冷冻要求,且降温幅度不均匀,容易形成冰晶。

3.降温速率问题:玻璃化冷冻时要求冷冻速率达20 000℃/min,但目前所使用的冷冻设备无法达到如此高的冷冻速率,只能将标本直接投入液氮。但研究表明,只要降温速率达到足以阻止冰晶产生的水平,那么他的作用即是次要的。例如以150~2500℃/min的降温速率玻璃化冷冻小鼠胚胎与20 000℃/min玻璃化冷冻时所获得的存活率无显著性差异,目前认为,以200℃/min的降温速率进行玻璃化冷冻即可获得较理想的复苏率。

4.复温时渗透性问题:由于玻璃化保护剂为高浓度保护剂,复温时,精子对水的渗透性高于对保护剂的渗透性,在保护剂尚未完全渗出细胞的情况下,大量水的进入引起精子顶体过度膨胀、破裂,造成渗透性休克。为了避免复温过程中的损伤,可使用非渗透性物质蔗糖,以维持细胞外液较高的渗透压,以抵抗大量水分子快速进入细胞内而引起的细胞渗透性死亡。

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