微量精子冷冻

统计表明,不孕不育在育龄夫妇中所占比例为10%~15%,其中,男性因素所占比例为30%~40%,而无精子症在男性不育中所占比例约为10%。1992年卵细胞胞质内单精子显微注射技术(ICSI)的成功,为无精子症和少、弱精子症患者的不育治疗提供了新的技术手段,理论上,只要睾丸或附睾穿刺到一条精子,就可进行ICSI,使无精子症患者拥有自己后代的梦想成为现实。但是睾丸或附睾穿刺为有创手术,且不能保证每次都能穿刺精子,如能将穿刺检查时获得的微量精子进行冷冻保存,以备以后生育所需,既能减少无精子症患者的痛苦,减轻他们的经济负担,又能随时复苏进行ICSI,降低取卵后穿刺得不到精子的风险,因此,微量精子冷冻将是精子库技术发展的一个重要方向。

依据微量精子在冷冻过程中所使用材料的性质,可分为生物材料和非生物材料。生物材料主要是不同物种的空卵膜和团藻球;非生物材料为麦管、5mm铜环、尼龙冷冻环、藻酸盐微球、ICSI管、琼脂糖微球等。

空卵膜微量精子冷冻法

1997年,Cohen等首次采用该法冷冻单精子获得成功,1998年,第一例利用该法冷冻的单精子进行显微授精的试管婴儿出生。目前,利用空卵膜冷冻保存经选择的单精子,是应用最为广泛和最具创新性的单精子冷冻方法,其操作方法为:在显微操作仪上,借助显微注射技术和细胞克隆技术,用激光或显微注射针在人类或动物的卵母细胞上打一个7.5μm左右的小孔,去除卵母细胞的胞质和胞核,将精子进行制动,用显微注射针将经过选择的精子注入空卵膜中,每个空卵膜最少可注入1条精子,最多可注入5~7条经过选择的精子,然后将注入精子的空卵膜置入含卵黄、甘油保护剂的麦管中,用程序冷冻仪进行程序冷冻或手工液氮蒸气冷冻。此外,也可先将冷冻保护剂注入已去除胞质和胞核的空卵膜中,再将经选择的精子注入,然后将含精子的空卵膜置入含保护剂的麦管中进行程序冷冻或手工液氮蒸气冷冻。人类或啮齿类的卵母细胞适于作为单精子冷冻的载体。

利用空卵膜为载体的单精子冷冻保存技术,特别适合冷冻精子活力极低患者的精子,因为极低的精子活力,在显微镜下,寻找一条活动的精子,可能会耗时1~2h,因此,冷冻方法的选择显得尤为重要。在技术操作上,卵母细胞极易观察并固定,利用显微技术去除细胞内物质亦确实可行,冷冻保护剂也很容易注入卵膜,复苏精子也极易从卵膜内移走进行ICSI。但是,尽管此方法已被成功用于临床,但要大量应用,还有安全性和技术性方面的限制。首先,此方法必须运用空卵膜作为精子冷冻保存的载体,其安全性及伦理问题是广泛用于临床的最大障碍,将暴露于动物制品和冷冻保存于人类空卵膜中的人类精子用于临床,精子有可能作为载体,将冷冻载体卵母细胞内未去除干净的遗传物质载入待受精的卵子,因此,其应用的安全性有待考虑;其次,在冷冻储存过程中,精子与LP3蛋白结合,可能诱发顶体反应而使精子复苏率及受精率下降;最后,空卵膜冷冻前的准备费时耗力,操作者技术的熟练程度及透明带上所穿孔的大小都能影响精子的冷冻保存。

以球形团藻为载体的微量精子冷冻

2004年,Just等首次运用球形团藻冷冻15例严重少弱精子症患者(100条活动的精子/ml)的精子获得成功。球形团藻是由1500~20 000个细胞紧密排列形成的一个球形结构。将经过选择的活动精子用显微注射针注入球体内,再将包含精子的团藻球移入事先已注入冷冻保护剂的麦管中,将麦管进行程序冷冻或液氮蒸气冷冻后浸入液氮中。使用时将麦管解冻,在团藻中用显微注射针取出精子,即可进行显微注射,运用此方法可以达到100%的活率并能获得50%以上的复苏率。但此方法在临床大量应用还存在以下不利因素:首先,存在遗传风险,被冷冻的精子暴露在团藻中,有可能将团藻的遗传物质在显微注射时带入卵子中,引发潜在的遗传风险,但是,冷冻前的放射性照射能有效的解决这个问题;其次,虽然团藻便宜且容易培养,但前期过程费时耗力,不适于大量用于临床。

以麦管为载体的微量精子冷冻

在现代辅助技术中,麦管被大量应用于冷冻受精胚胎,现在亦被应用于冷冻微量精子,1998年,Desai等应用此方法冷冻睾丸穿刺精子获得成功。其方法是:将直径0.2mm用于冷冻胚胎的空麦管截成2.5cm左右,一头用橡胶塞塞住,从附睾或睾丸穿刺取出的精子与保护剂按比例混匀,用显微注射针取10~20μl注入麦管中,另一端再用橡胶塞塞住,置液氮蒸气上30min,后放入液氮中冷冻保存。当进行ICSI时,可将麦管中冷冻精子复苏。2005年,Isachenko等应用此方法对1~5μl精子与保护剂悬液进行玻璃化冷冻取得成功。为了冷冻较多数量的精子,2007年,Koscinski等将30~500μl与冷冻保护剂混合后的精液标本放入麦管中,进行程序冷冻,获得了很好的冷冻效果。麦管冷冻微量精子简单易行,但是当极微量的精子用此法冷冻时,由于复苏后精子可能由于黏附在管壁上而丢失,同时经选择的单精子也不容易从麦管中取出。

直接冷冻法

为了克服麦管冷冻法精子黏附管壁的缺点,研究人员发明了人类微量精液冷冻的新方法—微滴直接冷冻法。少弱精子症患者的冷冻方法是:将精子离心,与适量冷冻保护剂混合,取50~100μl混合液直接滴在干冰表面或经液氮蒸气预冷的不锈钢盘表面,再将冷冻的微球放入冻存管后置液氮中保存。严重少、弱精子症或睾丸穿刺患者精液的冷冻方法是:将选择好的4~6条精子与保护剂相混合,滴在预冷的无菌塑料培养皿中,再用石蜡油覆盖,盖上盖子,用塑料膜封好,置液氮蒸气上2h后,放入液氮槽中贮存。2008年,Sereni等运用此法冷冻了6名睾丸穿刺患者的精子,其冷冻前平均仅有3.5%的精子具有活动能力,精子经选择后进行直接冷冻,复苏后获得了67%的活动率,将复苏获得的精子进行ICSI,51枚卵子有9枚受精,移植后,生化结果显示,3名患者成功受孕。虽然直接冷冻法已成功应用于临床,但该法也有以下不足:①在干冰或预冷的不锈钢表面直接冷冻精液,其安全性不能得到保证。②经选择的精子冷冻在无菌塑料培养皿上,其安全性可得到保证,但由于培养皿的形状及尺寸,不易为传统的液氮容器保存,同时由聚苯乙烯制造的培养皿也不能长时间在液氮中保存。因此,也限制了此方法的临床应用。

显微注射针冷冻法

与用麦管冷冻微量精子原理一样,经附睾或睾丸穿刺后取出的精子与保护剂混合后,在显微镜下用显微注射针挑选5~50条精子,再将含有精子混合液的显微注射针直接浸入液氮或置于液氮蒸气上20h后浸入液氮,复苏后可用于显微授精,运用此方法也可冷冻经选择的单精子。显微注射针冷冻法简单方便,但由于显微注射针针尖易碎且极易破损,故不能长期保存。同时,由于显微注射针不能被封闭,在贮存中直接与液氮接触,临床上也增加了交叉感染的风险,因此,其安全性亦限制了此方法的应用。

藻酸盐微囊冷冻法

藻酸盐为一种无细胞毒性的多聚糖,可从不同种类的褐海藻中提取获得,主要成分为甘露糖醛和古洛糖醛酸组成的重复单位,与二价钙离子相接合,在常温下呈胶体状态。精子可通过钙的螯合作用从藻酸盐中释放出来。运用藻酸盐的这种特性,将穿刺取出的微量精子进行优选、离心,与冷冻保护剂混合后立即加入藻酸盐,混合均匀,再逐滴滴入氯化钙溶液中,待藻酸盐颗粒凝固成微囊后进行洗涤,洗涤后将包含精子的微囊置入已预先添加冷冻保护剂的麦管中,用程序冷冻仪进行程序冷冻后浸入液氮中保存。使用时,待麦管中包含精子微囊的冷冻保护剂溶解后,放入柠檬酸钠溶液中溶解,精子经过离心,进行洗涤后可进行ICSI。良好的膜扩散性及藻酸盐本质特性是微囊法冷冻微量精子最大的优势。但是,精子上少量的藻酸盐残留可影响复苏精子的活动力。同时,在除去藻酸盐的精子洗涤过程中引起的精子丢失也限制了此方法的广泛应用。

冷冻环玻璃化冷冻法

1999年,冷冻环首先被用于冷冻胚胎,随着玻璃化冷冻研究的深入,冷冻环也被用于冷冻微量精子。严重少、弱精子症或睾丸穿刺患者的精液经选择后,与冷冻保护剂混合均匀,将直径1~3mm的尼龙环或铜环直接浸入含有精子的保护剂中,在表面张力的作用下,冷冻环表面形成一层薄膜,所需冷冻的精子均匀的承载在薄膜上,直接将冷冻环置入液氮中,10s后移入冻存管,液氮中保存。

改良微量精子冷冻法

为了克服以上微量精子冷冻方法的不足,研究人员利用麦管冷冻胚胎的原理,对微量精子的冷冻方法进行了改良,并已在临床上应用,其方法如下:在显微操作仪上,将2μl精子冷冻保护剂滴在长0.5cm、宽0.2cm的无毒、耐冻的塑料硬片上,用显微注射针将1~5条经选择的精子注入冷冻保护剂中,每100ml冷冻保护剂含丙酮酸钠1.17g、葡萄糖1.43g、甘氨酸1.5g、甘油15ml、蛋黄20ml、青霉素39 000U及链霉素19.5mg,再将已进行精子处理的塑料硬片置入长度为2.5cm左右、直径为0.2cm的安全耐冻塑料管中,两端热封口,用程序冷冻仪进行程序冷冻或手工液氮蒸气冷冻30min后放入液氮中冷冻保存。解冻时,剪开塑料管的一端,取出塑料硬片,直接放入37℃预热的矿物油中,待冷冻精液解冻后在显微操作仪上用显微注射针将精子取出,即可进行ICSI。此方法可避免交叉感染并可获得100%的复苏率,可大量应用于临床。

系统医学科普站点:天山医学院, 转载请注明出处:https://www.tsu.tw/edu/5368.html

小程序

内容拓展

中华皮肤病30年研究成果

心电图学一学就会

认识人体心脏,从解剖开始!

诱发心血管疾病的综合征

近视屈光激光手术矫正

适用于口腔科

做一个健康强健的男人!

智齿为萌出受阻的牙齿

内分泌与机体代谢医学