精子贮存方法和冷冻源

精子贮存方法

人类精子要进行冷冻贮存,必须要进行精子的分装,精子分装方法有三种:即颗粒法、细管法和安瓿法。颗粒法操作方便,但极易污染且无法标记,目前,基本上已不再用于冻存人类精液,现主要采用后两种方法。

一、细管法

细管是一种似麦杆的毛细塑料管,有0.25ml和0.5ml两种容积规格。细管冷冻法有许多优点,如冷冻降温过程中降温均匀、降温速率快、易标记、易保存、空间占据少,使用时精液损耗少等优点,且因两端密封贮存,大大降低了交叉污染的可能性。精液冷冻时,将精液和冷冻保护剂混合均匀后,利用负压的作用,将精液和保护剂混合物吸入麦管中,两端用聚乙烯醇密封。进行人工授精时,待冷冻精液复苏后,可剪开麦管两端,用特制的枪将麦管内复苏的冷冻精液注射到女性生殖道。

二、安瓿法

早期多采用药用安瓿,使用前高压灭菌,再将与保护剂混合好的精液注入安瓿内,体积约1ml,瓶口可用火焰熔封或塑料帽封口,否则液氮会进入安瓿中。复温时,由于液氮快速气化,体积骤然增大几百倍,极易引起爆炸,其安全性难以保证,目前,安瓿已被对精子无害的有盖塑料管取代,此种塑料管冷冻效果很好,不易爆炸,并有配套的小盒,存取十分方便,目前已被大多数精子库所采用。

冷冻源

早期精子冷冻及贮存均是利用干冰,但不久即发现,精子长期贮存于干冰中后,活率明显降低,其主要原因是因为干冰的最低贮存温度为-79℃,正处于精子冷冻过程中的再结(冰)晶阶段(-15~-80℃),精子可能由于再结晶而造成再次损伤。后来,人们发现了更为理想、有效的冷冻源——液氮。液氮为一种无色、无味、低黏度的液体,其沸点为-195.8℃,具有温度低、不自燃、不助燃、不易爆炸、来源丰富等特点,但极易蒸发,气化后体积可膨大655倍,因此冷冻精子在液氮罐中贮存时,液氮应定期添加,且液氮贮存罐不能密闭,以免发生爆炸;另因液氮温度极低,操作时应佩戴防护手套和护目镜,以免对皮肤和眼睛造成损伤;同时,液氮蒸气比重比空气大,蒸发后容易下沉,应防止液氮蒸气引起的窒息。

依据温度对化学反应速度的关系理论推测,生物体在-196℃低温下,可望保存几个世纪,但Smith和Steinberger在1973年指出,精子贮存大于36个月后,会引起精子存活率的下降,但这样的报道较少。目前,大多数冷冻生物学家认为,精子在冷冻过程的开始阶段,活率有部分丧失,而当置于-196℃液氮中贮存后,其活率不会有进一步的丧失。目前认为,精子长期贮存在-196℃的液氮或-142~-150℃的液氮蒸气中,冷冻复苏未有明显差异,而且,采用液氮蒸气贮存精子可以减少液氮消耗,部分或基本减少标本间的交叉感染。

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