人类精子作为一种特殊的组织细胞,具有细胞冷冻的全部特点,与冷冻其他组织细胞一样,在一定的低温条件下,让细胞降温、凝固、非损伤性结冰,促使细胞代谢降低,处于休眠状态,从而达到贮存细胞的目的。

细胞生活在细胞外液之中,并通过膜进行内、外物质的交换,水分可以自由通过细胞膜,水分的运动方向,主要取决于细胞内、外液中溶质的浓度差,即溶液渗透压的高低。在细胞冷冻过程中,随着温度的不断下降,细胞会发生一系列的物理化学变化。细胞外液中作为各种电解质溶剂的水分首先因为温度的降低,形成细小的颗粒状冰晶,导致细胞外液中水分减少,电解质浓度增加,细胞外液渗透压升高,细胞内外渗透压失去平衡,水分由细胞内向细胞外渗透,于是细胞由于自身脱水而发生皱缩。冷冻过程中细胞外液中形成的冰晶是热交换的不良导体,具有一定程度的隔热作用,所以外界温度的降低对细胞内液的影响不明显。随着外界温度的持续降低,加上细胞因为脱水,水分减少,这些综合因素作用的结果,使细胞不产生或仅产生少量的冰晶。利用冷冻过程中产生的渗透压差使细胞脱水,产生皱缩,使细胞器或细胞膜不损伤或仅发生轻微损伤,这就是细胞冷冻的基本原理。

细胞冷冻过程中,冰晶主要在细胞外形成还是细胞内、外同时形成,主要取决于冷冻降温速度。快速冷冻过程中,细胞内形成的冰晶将引起细胞超微结构的机械性损伤,造成细胞死亡,这一现象称为快速冷冻损伤,又称冰晶损伤。反之,在慢速冷冻过程中,细胞外液中由于冰晶的大量形成,渗透压升高,细胞内水分由于渗透压差快速向外渗透,细胞就有可能由于过分暴露于高浓度的溶质环境中,引起细胞严重脱水而死亡,这种现象称为慢速冷冻损伤,又称溶质损伤。正是基于细胞冷冻损伤的形成机制,在细胞冷冻贮存过程中,需选择一种不引起快速冷冻损伤,并可获得细胞最大冷冻复苏率的降温程序,依据细胞冷冻过程中不同的降温阶段,采用不同的降温速率。但实际上,要发现这种理想的降温程序是极困难的,因为在引起细胞损伤的降温速度之间并无明显界限。因此,仅靠不同的降温阶段,采用不同的降温速度尚不足以达到理想的冷冻效果。在细胞冷冻时,加入一些物质,以保护细胞不受损害或少受损害,以达到最佳冷冻保护效果,这类物质我们称为冷冻保护剂。借助冷冻保护剂的保护作用以及合理的冷冻速率,才有可能获得理想的冷冻效果。不同组织的细胞具有不同的冷冻易感性,由于精子较其他细胞小,仅有很少的细胞质,且胞质中水分含量较其他细胞少,相比其他细胞,精子在冷冻过程中,能发生足够的脱水和皱缩,低温条件下,不会形成过多的细胞内冰晶,因此,精子适宜冷冻保存。

从本质上讲,细胞的冷冻过程实际是一个脱水的过程,当温度降低到冰点时,细胞外液首先凝固,化学势能降低,细胞内水分通过细胞膜渗到细胞外,在细胞外结晶,而此时,细胞内液不会凝结。随着温度的持续降低,细胞内也开始形成冰晶,细胞极易在此阶段死亡,因此,此阶段应快速通过。当温度降至-196℃时,细胞处于休眠状态,可在液氮中长期贮存。

细胞在冷冻过程中,冷冻损伤的发生是不可避免的,但有关损伤的机制,仍存许多争议。多数学者认为,引起细胞冷冻损伤的主要因素为渗透压的改变和细胞内冰晶的形成,因此,冷冻保护剂和降温速度的选择,对减少冷冻损伤至关重要。冷冻保护剂中的渗透性保护剂可以渗入细胞内,与水分子结合,降低细胞内溶液的凝固点。非渗透性保护剂能稳定细胞膜的结构,当细胞外液结晶大致完成时,细胞内液还处于超临界状态,冰晶尚未形成。另外,渗透性冷冻保护剂还能降低细胞内未凝固部分溶液的盐浓度,有效防止细胞因渗透压的改变而破裂。降温速度决定了细胞内冰晶形成的速率和大小,冷冻过程中降温速度适宜,渗透性保护剂可充分渗入细胞内,细胞内水分向外渗透时间充足,引起细胞脱水皱缩,冰晶主要形成于细胞外,细胞内无冰晶或仅有微小冰晶形成。如降温速度过快,细胞来不及充分脱水,产生超冷效应(supercooling effect),在冰点下,细胞内液中暂无冰晶形成,但随着温度的持续降低,则会在细胞内大量形成冰晶,造成细胞器和细胞膜结构损伤,引起细胞死亡。此外,复温速率的选择也会对细胞的存活率造成影响,如复温过慢,在再结(冰)晶温度阶段,细胞内已形成的冰晶会增大,造成细胞二次损伤;如复温过快,因细胞外液冰晶融化,细胞外渗透压降低,水分大量内流,造成细胞肿胀甚至破裂。

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