精子制备方法:密度梯度离心法(Percoll、PureSperm)

密度梯度离心法的原理是正常精子与畸形精子、不活动精子及精液中的其他细胞成分在运动能力、运动轨迹和浮力密度等方面出现差异,在密度梯度溶液柱中运行的能力也有差异,离心后,精液中的各种成分在密度梯度溶液柱中达到平衡,停留在各自的等浮力密度点上,从而达到分类正常精子。不连续密度梯度离心法是目前较常用的方法,即在离心前不同密度的溶液分层制成不连续密度梯度溶液柱。Aitken等认为不连续密度梯度离心可回收高质量的精子,浮力密度在一定程度上能保护精子免受离心力的损伤。

现已证实,与上游法比较,密度梯度离心法能回收更多的形态正常的精子,并明显增加精子的活力和体外生存能力。尤其是对于精液严重异常者(少、弱、畸精子症等),更能体现其较高回收率的优越性。

Percoll密度梯度离心法

Percoll是一种用聚乙烯吡咯烷酮包被胶体硅形成的介质,具有分离活动精子的作用。使用的方法有单层或多层由不同密度Percoll液组成,后者又可分为连续或不连续Percoll密度梯度离心。

单层法多是用20%Percoll 4ml置于试管底部,然后将液化后的精液加在其上,离心30min后活动力强的精子穿过整个Percoll介质,沉积于试管底部,而活动力差的、死精子、畸形精子及精浆、有害细胞成分和杂质则被留在Percoll液面及其中,小心收集试管底部液体,即可得到活力及形态均好的精子。此法因不能很好地分离活力及形态较差的精子,现已较少用。

多层法就是应用不同密度梯度的Percoll(25%~80%)各1ml,放入一无菌无毒的16mm×125mm试管中,密度最大者放入试管底部,向上依次递减,表面密度最小,这样就形成了不连续的Percoll密度梯度,将液化后的精液放在最低密度层的上方,在离心后,试管最底部的部分即为所需的活动力强的精子。多层法可分为2、4、8、12层法。经过多年的临床应用,发现应用简化的二层45%及90%的Percoll密度梯度,可获得与其他多层法相同的结果,所以,现在应用最普遍的是45%及90%的二层Percoll密度梯度离心法。

操作步骤与PureSperm梯度离心法相同。

为了了解Percoll所含成分可能对精子生物学功能产生的有害影响,F.Sapienza等对动物精子及人类IVF-ET过程中的精子处理方法进行研究发现,与上游法比较,应用Percoll密度梯度离心法的精子回收率明显增高,而两种方法在精子的活动率、顶体反应率及SPA阳性率方面均无显著差异,而且,其体外受精率明显增高,特别是在精液质量差时更显著(46.7%对11.6%)。Collue等进一步研究发现,经Percoll处理过的精子含有更多的核蛋白P2(精核蛋白),因此更容易在卵细胞内浓缩,所以具有更高的受精能力。

1996年以后,国外IVF中心已不再在临床应用Percoll处理精液,因为Percoll有以下缺点:①Percoll含有较高量的内毒素;②用Percoll处理过的精液标本,用电子显微镜观察,发现在精子表面黏附了胶体硅微颗粒,他们在精子接触的组织中会引发炎症反应。

PureSperm密度梯度离心

PureSperm是一种用HEPES缓冲的亲水性硅烷包裹的氧化硅胶体溶液,用两层密度梯度离心法能有效的将活动精子与死精子、白细胞及其他精液中的混杂成分分离。PureSperm是一种新产品,它的最大特点是毒性低,而且试剂配制、洗涤操作也较简便。市售的有已配置好的PureSperm“上层液态”(40%)与“下层液态”(80%),可方便直接制成两层密度梯度,也有原液与稀释液出售,用来配制40%与80%密度的液体。

具体步骤:

  1. 取2mL 80%PureSperm液加入到一支15mL离心管底部,再沿管壁缓慢加入2mL 40%Pure-Sperm液,注意勿混合,两液体间应有清晰的界面;
  2. 在两液体表面缓慢加入已液化的精液2ml,注意也应保持其与40%PureSperm液之间的界面清楚;
  3. 室温下,以300g离心20min;
  4. 去上清液,将沉淀吸到另一支含5ml培养液的试管中,充分混匀,再次以200g离心10min;
  5. 弃上清液,再加入培养液,将精子浓度调至1×105~3×105/mL,置37℃5%CO2培养箱内备用。

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