精子制备常用方法:上游法、精子下游法

上游法

上游法主要利用活动精子的游动能力,即能游过液体界面进入不同的培养液,从而与死精子、活动力差的精子、凝集精子、畸形精子、红、白细胞及其他有害成分及杂质自行分离,由于纯物理作用而使精子重新分布,故理论上不影响精子的生物学特性。适用于精液常规大致正常的精液标本,特点是回收到的精子活动率明显提高,正常形态精子百分率增加,缺点是精子的回收率低,精子密度低和活动力差的标本不适用。

直接上游法

  1. 充分混匀精液样本。
  2. 在10ml的圆底试管中吸取2ml的培养液,然后将约1.5ml液化后的精液小心地加到试管底部,注意培养液与精液之间有一界面,加精液时应小心不要扰乱这个界面。
  3. 试管静置于室温下10~120min。
  4. 吸取含活动精子的上层培养液,离心200g×5min。
  5. 弃上清液,再加入2ml培养液,离心200g×5min。
  6. 弃上清液,留沉淀待用。

直接上游法可收集90%以上的高活动率精子,同时对形态正常的精子也起到筛选作用。有资料表明,直接上游90min后能平均减少41%的形态异常精子,也有研究表明上游90min后培养液中的精子密度不会再提高,一般65min左右密度达到峰值。形态异常精子的比例是随着上游时间的增加而增加的,在精子密度达到最佳后还会继续上升,因此时间延长能使形态异常的低活力精子也上游到顶端,上游时间应根据精液的参数而适当调整。

沉淀上游法

  1. 将1ml精液与3ml培养液混匀,对于精液黏度过大的用吸管或针头反复吹打。以400g离心10min。
  2. 弃上清液,加入2ml培养液,将沉淀物——精子充分混匀后,300g离心5~8min。
  3. 尽量弃去上清液,用吸管吸取0.5~0.75ml培养液,小心加入到沉淀的表面,避免搅动培养液与沉淀的界面。
  4. 将试管倾斜45°角,置于37℃5%CO2培养箱内孵育30min。对于活动力非常强的高质量精子,放置10min即能上游,而活动力差的精子,可延长培养时间达1h。
  5. 小心吸取云雾状上清液,置于另一无菌试管中。
  6. 精子计数,置于37℃5%CO2培养箱备用。

沉淀上游法是ART程序中最常用的方法,最早由Lopata等提出。下列患者的精液一般采用沉淀上游法:因抗精子抗体而将精液收集在含血清培养液者,逆行射精者,精液黏度过大者,精液体积较少者。

Gabril及Sapienza等报道,应用上游法处理正常精液,可使精子的活动力增加29%~32%,形态正常精子增加20%~24%,但精子数量减少了80%~88%;而对少、弱、畸精子症者,活动率增加35%~42%,形态正常精子增加25%~28%,但精子数量减少了90%~93%。所以,目前均主张对精液正常者应用上游法,而对精液严重异常者使用Percoll密度梯度离心法能得到更好的效果。

精子下游法

  1. 将1.0ml灭活血清置于试管底部。
  2. 将0.5~1.0ml洗涤过的精子悬液轻轻置于血清上,使形成界面。
  3. 在37℃中孵育10min。
  4. 用一细长吸管插入试管底部,吸取包含活动精子的大部分血清备用。

上游法要克服重力向上游动,因而回收率低,而下游法由于避免了这一缺点,因而提高了精子的回收率。

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