流式细胞术的样品制备及保存

FCM的实验对象是单个细胞悬液,故睾丸组织必须分散为单个细胞,精液也要分散为单个细胞。下面介绍其样品的制备:

培养细胞分散为单个细胞

  1. 将培养细胞中的培养液倒掉;
  2. 加入少量0.25%胰酶、过一遍瓶倒掉;
  3. 加入1~2ml 0.25%胰酶,在倒置显微镜下观察,见细胞稍变圆时,静置消化2~3min,待细胞逐渐变白,停止胰酶作用,弃去胰酶。应注意胰酶消化时间与消化温度、细胞类型及细胞生长情况有关;
  4. 加入3~4ml无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),用吸管反复操作,使之成为单个细胞悬液,移入离心管中;
  5. 离心,去上清液,约留0.5ml细胞悬液,用振荡器使细胞分散;
  6. 用细滴管或注射器将细胞迅速注入4℃冷乙醇中(乙醇浓度为70%),然后保存于4℃冰箱中。

实体组织分散为单个细胞

具体方法参见文献,主要步骤如下(酶消化法):

  1. 将睾丸组织剪碎,用Hank液洗涤;
  2. 胶原酶消化(25μg/ml,33℃振荡30min);
  3. Hank液洗2次;
  4. 0.25%胰蛋白酶消化30min;
  5. 用60μm不锈钢网过滤;
  6. 滤过细胞悬液离心(500r/min,10min);
  7. Hank液洗,离心2次;
  8. DNA酶(1U/ml)消化,洗涤;
  9. 调整细胞浓度为1×107/ml。

将细胞悬液充分混匀,吸取0.2ml,加入5ml冰冷的含0.1%TritonX-100、0.3mol/L NaCl的0.01甘氨酸氢氧化钠缓冲液(pH10.0)。然后依次加入200g/ml的溴乙锭(ethidium bromide,EB)染液0.1ml及10mg/ml RNA酶Tris液0.2ml。混匀置于暗处4℃10min,再置于室温下5~10min,取一滴在荧光显微镜下检查,若细胞核呈明亮的橙红色荧光,即可上机分析。

样品的长期保存方法

  1. 首先配制枸橼酸盐缓冲液,其配制方法为:将85.5g蔗糖、11.76g枸橼酸钠溶于800ml蒸馏水中,再加入50ml二甲亚砜(DMSO),加蒸馏水至总体积达到1000ml,将pH值调至7.6。
  2. 被保存的样品如果是单个细胞或者是实体组织针吸样品,细胞悬浮于400μl枸橼盐缓冲液中,然后置于聚丙烯管中,立即将此管浸入干冰和99%乙醇的混合物中,然后移至-80℃的冰箱中保存。
  3. 被保存的样品如果是实体组织,可直接把样品置入干燥的聚丙烯管中,快速冷冻(方法同上)。
  4. 样品分析前,将冰冻的样品块快速放入37℃的水浴中融化,以小块实体组织存贮的样品融化后,再悬浮于枸橼酸盐缓冲液中,然后可进行常规的DNA染色和FCM分析。这种方法可保存样品达1年之久,其DNA直方图分析不发生变化。因此,能进行大量的对比实验。

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