活性氧类物质(ROS)的测定

活性氧类物质(ROS)一般均具有极活跃的化学性质,其存留时间很短,易受其他物质的干扰,除非采用特殊方法检测外,否则很难检测出其含量。目前,已报道的ROS检测方法主要有化学发光法、分光光度法、酶分析法、电子自旋共振法、气相色谱法、比色法、高效液相色谱法以及高效液相色谱-电化学法、电子顺磁共振波谱法等。

下面介绍化学发光法测定精子悬液ROS的检测方法:

一、原理

在该方法中,需要敏感的光度计和化学发光探针,如鲁米诺,检测精子所产生的微弱光信号。以下介绍的方法是联合应用鲁米诺和辣根过氧化物酶,检测过氧化氢产生的敏感方法。其他探针(如光泽精)也可用于检测人精液中的ROS。由于精子表面没有甲酰三肽(甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸,formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,FMLP)受体,所以,以FMLP为探针所产生的信号对白细胞是特异性的,可用含已知数量多形核白细胞的悬液来校准数据。

二、试剂

  1. Hanks,平衡盐溶液(Hanks,balanced salt solution,HBSS),不含酚红。
  2. Krebs-Ringer液(Krebs-Ringer medium,KRM),不含酚红。
  3. 鲁米诺(25mmol/L):将29mg鲁米诺(5-氨基-2,3-二氢-1,4-二氮杂萘二酮)溶解于10ml二甲亚砜(DMSO)中。
  4. 辣根过氧化物酶(IV型,310IU/mg蛋白):取5mg(1550IU)溶解于1ml Krebs-Ringer液中。
  5. FMLP(白细胞特异性探针,10mmol/L):将44mg FMLP溶解于10ml DMSO中。
  6. PMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐,phorbol 12-myristate 13-acetate),1mmol/L储存液:取6.2mg PMA溶解于10ml DMSO中,使用时,用DMSO稀释100倍,得到10μmol/L的工作液。
  7. 酵母多糖。
  8. 明胶:0.1%(1g/L),溶于HBSS中。

三、酵母多糖的调理

  1. 溶解500mg酵母多糖于10ml HBSS中。
  2. 剧烈漩涡振荡。
  3. 在加盖的烧杯中煮沸20min,以防蒸发。
  4. 500g离心5min。
  5. 加10ml的HBSS洗涤沉淀。
  6. 重复操作4和5,再洗一次。
  7. 将沉淀重悬于5ml的新鲜人血清中,轻柔吹打混匀。
  8. 孵育20min。
  9. 500g离心5min。
  10. 用10ml的HBSS洗涤沉淀。
  11. 重复操作9和10,再洗一次。
  12. 将沉淀重悬于10ml HBSS(含0.1%明胶),使终浓度为50mg/ml,轻柔吹打混匀。
  13. 将配好的悬液储存于-20℃的冰箱中备用。

四、检测自发产生的ROS

  1. 混匀精液标本,取一定体积的精液(含10×106个以上精子)用于ROS检测。
  2. 用Krebs-Ringer液洗涤精子,并调整其浓度为10×106精子/ml。
  3. 取400μl洗涤后的人精子悬液,悬于不含酚红的Krebs-Ringer液中,加入一次性光度计容器中,小心操作,避免产生气泡。
  4. 加4μl浓度为25mmmol/L的鲁米诺。
  5. 加8μl浓度为1550IU/ml的辣根过氧化物酶溶液。
  6. 37℃下监测化学发光信号约5min,直至信号稳定。

五、FMLP刺激白细胞产生ROS

取2μl浓度为10mmmol/L的FMLP,加入上述样本中以刺激精子悬液中的白细胞产生化学发光信号。

六、酵母多糖刺激白细胞产生ROS

取20μl的调理酵母多糖混合液,加入上述样本中以刺激精子悬液中的白细胞群产生化学发光信号。

七、PMA刺激白细胞和精子产生ROS

  1. 将PMA储存液用DMSO按1∶100的比例稀释成10μmol/L的工作液。
  2. 待FMLP或调理酵母多糖的信号消退。
  3. 加入4μl浓度为10μmol/L的PMA工作液处理精子悬液(终浓度为100nmol/L),使精子产生化学发光信号。

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