精子酶学染色

琥珀酸脱氢酶

琥珀酸脱氢酶(SDH)是三羧酸循环中的第6个酶,它催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸,脱下的氢最后生成ATP。SDH主要分布在精子尾部中段,它与线粒体结合较牢固,SDH活力的强弱,反映精子能量代谢的活跃程度。

一、作用液的配制:

  1. 0.1mol/L琥珀酸钠5ml;
  2. 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)5ml;
  3. 氮蓝四唑(NBT)10mg;
  4. 二甲亚砜(DMSO)5ml;
  5. NBT先溶于DMSO中,然后加入琥珀酸钠及磷酸缓冲液中。

二、染色步骤:

  1. 洗涤精子,新鲜精液标本待液化后或冷冻精液标本解冻后用生理盐水洗涤3次;
  2. 制作涂片,用洗涤好的精子悬液进行涂片,放室温内自然晾干;
  3. 染色,涂片晾干后与配好的作用液在37℃水浴箱中反应3h;
  4. 生理盐水洗3次;
  5. 甲醛-钙固定液固定10min;
  6. 80%乙醇5min;
  7. PVP封片。

三、对照:①免底物;②在标准作用液中加入丙二酸钠(3.7mg/ml)。

四、结果:酶活性表现为蓝紫色沉淀(颗粒状物)。

3β-羟基甾体脱氢酶

羟基甾体脱氢酶是催化环戊烷多氢菲的甾体脱氢酶系,3β-羟基甾体脱氢酶(3β-HSDH)参与甾体合成,而且和细胞的生理活动有关。

一、孵育液的配制

  1. 1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)0.75ml;
  2. N-苯甲基甲酰胺0.3ml;
  3. NBT 3ml;
  4. DPN(辅酶I)2.8ml;
  5. 脱氢表雄酮0.3mg;
  6. 双蒸水1.95ml
  7. NBT 1mg/ml双蒸水;
  8. DPN 3mg/ml双蒸水。

二、染色步骤

  1. 精子洗涤(同上);
  2. 用洗涤好的精子悬液进行涂片,室温自然干燥;
  3. 37℃水浴箱中与孵育液作用3h;
  4. 0.1mol/L PBS(pH7.2)洗1次;
  5. 10%中性福尔马林固定5min;
  6. 双蒸水洗1次;
  7. PVP封片。

三、对照:免底物和辅酶。

四、结果:酶活性位置呈紫蓝色到蓝色或蓝棕黑色。

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