单纯疱疹病毒(HSV)感染的检查

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)是疱疹病毒科的成员,属DNA病毒。在发现该病毒以来,从多种动物体内分离到80余种不同的HSV。人类常见且重要的疱疹病毒有:单纯疱疹病毒1和2型(HSV-1、HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、EB病毒(epstein-barr virus,EBV)以及巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)。人疱疹病毒主要通过接触黏膜表面而传染。此类病毒都能通过胎盘屏障,其他传播途径为器官移植、性传播或通过应用污染的血液制品而感染。

HSV通常是隐性感染,但也可引起严重感染,甚至是致命的全身感染。此病毒感染后最常见的临床症状是皮肤黏膜上形成局限的成堆的疱疹。原发性单纯疱疹的表现有:疱疹性口龈炎、疱疹病毒性外阴阴道炎、疱疹性角膜结膜炎、湿疹性疱疹、疱疹性脑膜炎、新生儿疱疹。尽管HSV不论是显性或隐性的原发性感染后都产生特异性抗体,但是HSV能以潜伏的形式持续存在,并且后来可被各种非特异性刺激再激活。HSV-1与大部分生殖器以外的感染有关,而HSV-2主要引起生殖器和新生儿疱疹性感染。另外现已发现HSV-2与子宫颈癌的发生有关。根据血清学研究的结果,HSV-1较HSV-2常见。

目前,判断疱疹病毒感染的常用实验方法有:①病毒分离;②病毒或病毒抗原测定,使用的方法有免疫电镜、细胞学方法、免疫荧光法、对流免疫电泳及ELISA方法等;③抗体测定,有补体结合试验(CF)、中和试验(NT)、免疫荧光试验(IFA)、间接血凝试验(IHA)、ELISA和放射免疫试验(RIA)等。病毒分离是直接诊断技术中较特异和敏感的方法,但实验条件要求高,时间长,现多将细胞培养增殖病毒与快速免疫学诊断技术结合起来,以弥补单用细胞培养分离病毒耗时长和单用免疫学方法检测标本中病毒抗原阳性率较低之不足。HSV-1和HSV-2两者DNA的同源性约为50%,每型HSV均含有共同抗原和型特异性抗原。HSV含有多种糖蛋白,据分析,糖蛋白gD为HSV-1和HSV-2所共有,gC为HSV-1型特异,gF为HSV-2型特异。可用基因组成和抗原构成来区别HSV-1和HSV-2。

单纯疱疹病毒抗原的检测

抗HSV单克隆抗体用作包被抗体,兔抗HSV多克隆抗体用作二抗,酶标记抗体用HRP羊抗兔IgG。

一、操作方法

标本采集用消毒棉拭子擦拭病灶或宫颈数次,然后将该棉拭子放入0.4~1ml 0.01mol/L pH 7.4PBS中,浸出液供实验用。泪液标本用消毒滤纸条放入穹隆部停1min左右,待吸满泪液后取出放入0.25ml PBS中。为保证阳性检出率,可重复采样3次。标本采集后若不能立即检验,应放30℃保存。

二、检验方法

  1. 用包被液将抗HSV单克隆抗体1∶100稀释后,置包被酶标反应板,每孔0.1ml,4℃过夜后备用。用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞制备的小鼠腹水同法包被作为阴性对照。
  2. 每份标本加一个试验孔和一个对照孔,每孔加样0.1ml;每次试验同时设阳性对照(HSV阳性抗原)和阴性对照(PBS)各一孔,40℃、40min,洗板3次。
  3. 将兔抗HSV免疫血清用含3%绵羊血清作1∶50~1∶200稀释后加入各孔,每孔0.1ml,40℃、40min,洗板3次。
  4. 加入工作浓度的HRP-羊抗兔IgG,每孔0.1ml,40℃、40min,洗板3次。
  5. 加入底物(TMB-H2O2)呈色,10min后加2mol/L H2SO4终止反应。

三、结果判定

①目测包被对照孔和阴性对照孔无色,阳性对照孔显黄色,实验孔呈黄色者可判为阳性。根据显色的深浅,可判定其阳性程度。②比色用酶标仪测450nm吸光度值(A),以P/N≥2.1判为阳性。

单纯疱疹病毒感染的血清学检查

一、细胞与试剂

  1. HSV-1Stoker株,HSV-2Sav株,在乳兔肾单层细胞中传代。
  2. Hela细胞,培养于Eagle液或RPMI 1640培养液(培养时均含10%小牛血清,而维持液均只含2%小牛血清)中。
  3. 抗原片:将HSV-1、HSV-2分别接种Hela细胞单层,待细胞病变达2+时,将细胞摇落,悬液经3000r/min离心10min,沉淀细胞涂于印有小圈的载玻片孔内,干后冷丙酮4℃10min,置密封塑料袋内,4℃保存。
  4. 底物溶液3,3′-二氨基联苯胺(DAB)4mg加二甲基亚砜0.2ml(或丙酮0.5ml)溶解后,加入0.01mol/L pH 7.4PBS 10ml中,再加入30%H2O250μl,备用。

二、操作

  1. 将待测血清用0.01mol/L pH 7.4PBS自1∶5开始作双倍稀释达1∶1280,依次加入抗原片孔内,37℃湿盒30min。
  2. 流水冲洗去多余血清,用上述PBS洗3次,每次5min(下同)。
  3. 滴加工作浓度HRP标记的抗人IgG,37℃湿盒30min,PBS洗3次。
  4. 加入底物溶液,避光反应15min,倒去底物溶液,于无水乙醇中浸泡3min脱水。

结果观察

滴加中性树脂封片后镜检,根据阳性细胞数和染色程度,判定为阳性或阴性,每次试验需设置阳性与阴性对照。

目前HSV的检测,也有商品试剂盒出售,包括抗原、抗体及核酸测定试剂等。

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