巨细胞病毒(HCMV)感染的检查

人巨细胞病毒(HCMV)在人群中广泛存在,用测定HCMV IgG、HCMV IgM的方法调查HCMV感染率,发达国家为40%~60%,发展中国家为95%~100%。HCMV感染所致疾病的临床症状和体征等表现为非特异性的,而且许多HCMV感染的患者并不表现出任何临床症状而成为潜在感染状态。健康人群感染HCMV后,一般表现为轻微症状或无症状感染,但在免疫功能低下的人群,如器官移植、艾滋病、肿瘤患者及婴幼儿则可导致严重后果;早孕妇女感染HCMV,可通过胎盘引起胎儿宫内感染,从而导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓和新生儿先天畸形等。因而HCMV感染是一个值得重视的问题。近年来,HCMV实验室诊断在原有的实验方法基础上,主要在早期、快速和定量方面进行大量研究。目前,HCMV实验室诊断方法主要有以下几点。

一、检查巨细胞包涵体

在患者新鲜尿液、活检组织或尸检标本切片寻找巨细胞包涵体;此法现已弃之不用。

二、HCMV组织培养

  1. 培养液:RPMI 1640液,加入20%小牛血清,即常用的细胞培养液。
  2. 实验用细胞系:人二倍体胚肺细胞系(HDEL)。
  3. 实验标本:精液、尿、血液、胸水、腹水、支气管灌洗液、脑脊液等,均可用于本试验。
  4. 操作方法(以尿为例,其他类同):将HDEL细胞系培养于含20%小牛血清的RPMI 1640液中,待HDEL细胞系长成细胞单层后,将患者新鲜尿液处理后(高速离心沉淀)接种人胚肺纤维母细胞,定期观察细胞病变(CPE)情况。如有CPE产生,证明原培养物中HCMV阳性;10d后,若无CPE,将细胞盲传一次,仍无CPE,可报告HCMV培养阴性。
  5. 报告结果:尿液(或其他标本)HCMV培养阳性(或阴性)。

三、HCMV抗体检测

HCMV抗体检测的方法较多,包括CF、IHA、IFA、免疫印迹试验(IB)、ELISA及RIA等。其中ELISA和RIA具有简便、快速、敏感性好和特异性强等特点,是较为常用的检测方法。目前市售的ELISA测定HCMV-IgG和HCMV-IgM试剂盒,是HCMV抗体检测最简便的方法。应该注意的是,HCMV-IgG抗体阳性,仅能说明患者有既往感染(或称原发性感染)史,HCMV-IgM阳性则表明有活动性感染。两种抗体同时测定,有助于判定患者HCMV感染及活动状况。

四、HCMV抗原的测定

HCMV抗原组成非常复杂,有数十种之多。一般认为,患者原发性感染的早期所表达的蛋白为HCMV的即刻早期抗原,继发性感染表达的多为HCMV的晚期抗原,因此,可用单克隆抗体来鉴别患者血清中的病毒抗原成分。以判定患者为原发性感染或继发性感染。这对于某些患者,如早孕女性,因为能判定其为原发性还是继发性感染,对于判定胎儿的损伤程度有一定的临床意义。

(1)HCMV早期抗原的免疫荧光检查(detection of early antigen fluorescent foci,DEAFF) 此法是在传统的细胞培养基础上发展起来的。细胞培养虽然是经典的HCMV诊断方法,但此法费时、费力、敏感性低,不利于HCMV的早期快速诊断。DEAFF法通过测定HCMV DNA合成前产生的早期抗原(EA)来确定HCMV存在与否。方法为:将待测标本接种到HDEL细胞单层上,培养24h后用荧光素标记的鼠抗HCMV单克隆抗体,直接测定HCMV感染的α和β蛋白。

细胞与试剂:HDEL细胞系。RPMI 1640液(含20%小牛血清)。

操作方法:(以尿为例,其他类同)将HDEL细胞系培养于含20%小牛血清的RPMI 1640液中,在培养皿中放入特制的小盖玻片,待HDEL细胞系长成细胞单层后,将患者新鲜尿液处理后(高速离心沉淀)接种HDEL细胞系,24h后将玻片取出,用无血清RPMI 1640液洗3次,直接加入荧光素标记的小鼠抗HCMV早期抗原的McAb,37℃、30min,洗片后直接用荧光显微镜观察结果。出现荧光颗粒为HCMV早期抗原阳性。

报告结果尿液(或其他标本)HCMV早期抗原阳性(或阴性)。

(2)白细胞中HCMV抗原测定 这是一种直接诊断活动性HCMV感染的方法。将白细胞固定在玻片上,加入HCMV单克隆抗体(抗PP65)温育后,加入荧光素标记的羊抗小鼠抗体(二抗),洗片后可直接用荧光显微镜观察结果。也可用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠抗体染色后,加入底物显色,2mol/L硫酸终止反应后用光学显微镜观察结果。凡细胞中有显荧光颗粒(荧光法)或棕黄色颗粒的,即为阳性细胞。

操作方法及判定结果同上。

五、HCMV DNA的PCR测定方法

PCR技术自1985年Saiki等首次报道以来,此技术迅速发展,出现了多种用途的PCR,如竞争PCR、差异PCR、不对称PCR、巢式PCR、加端PCR、原位PCR、免疫PCR、锚定PCR、重组PCR和定量PCR等。HCMV的测定,可用单次和套式PCR,单次PCR可检出100fg的HCMV DNA,而套式PCR可检出5~10fg的HCMV DNA。PCR检测技术具有简便、快速、敏感及特异等特点,对检测标本要求不高且较为广泛,几乎包括所有临床标本,如血液、尿液、精液、支气管洗液、羊水及石蜡包埋的标本均可用于PCR测定。

1.引物的选择

应用PCR进行HCMV DNA检测,首要的问题是引物的选择与设计。HCMV DNA在结构上含有三种感染细胞特异性多肽的区段,即刻早期蛋白区(IEP)、早期蛋白区(EP)和晚期蛋白区(LP)。这三种多肽均有免疫原性。在进行HCMV PCR时,引物的设计应考虑到这类不同抗原的编码基因。选取哪一段作为引物可根据不同的情况而定,应注意的是引物所位于的区域为病毒较特异的序列,即该序列为其所特有,而且又存在于不同的突变株,以便检测不同的突变株,以保证DNA序列扩增的特异性及实用性。因此,一般引物均设计在HCMV特异的保守序列。Demmler等设计的位于900~925nt及2101~2125nt的一对引物,其序列为:

p1:5′CACCTGTCACCGCTGCTATATTTGC3′

p2:5′CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT3′

应用该对引物扩增HCMV可产生一条长约400bp、含HindⅢ酶切点的DNA片段,该序列编码HCMV的晚期抗原蛋白。

2.标本处理

精液、血清、尿液等液体标本可直接用苯酚-氯仿抽提,用乙醇沉淀,蒸馏水溶解后用于PCR扩增,组织标本需绞碎,水溶后再用上法提取(详细方法请参阅聚合酶链反应一节)。

3.PCR扩增

  1. 取5~10μl提取检样或其他模板DNA溶液,加入10×PCR缓冲液10μl,使最终反应液中含50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH 8.4),1.5mmol/L MgCl2及0.01%明胶;
  2. 两种引物各2μl(浓度10μmol/L);
  3. 加入dNTP 10μl(最终为0.2mmol/L);
  4. 加高纯水,使反应体积为100μl;
  5. 将反应液100℃煮沸10min,加入2UTaq DNA聚合酶及50μl液体石蜡油以防蒸发;
  6. 94℃1min,55℃1min,70℃1.5min,循环40次;
  7. 扩增产物的电泳分析:20μl扩增产物加入1/10体积的终止缓冲液,在1%琼脂糖-溴乙锭电泳后在紫外灯下观察结果,此法可测出原检样中0.15fg的HCMV DNA。

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