风疹病毒感染的实验室检查

风疹病毒(rubella virus)属于披膜病毒科风疹病毒属,为非虫媒披膜病毒的一种,外层为不规则球形,直径50~70nm。外层为一松散的囊膜,表面有5~6nm的小突起。中央为核壳体,是20面体,直径30~40nm。病毒在蔗糖中的浮密度为1.16~1.19g/ml,在CsCl中的浮密度为1.20~1.23g/ml。沉降系数240S,核壳体沉降系数150S,相对分子质量为2.6~4.0×106

病毒核酸为单链RNA,正链有感染性。病毒含3~8个结构蛋白,主要为E1、E2和C蛋白。E1、E2在病毒外膜,是糖蛋白,相对分子质量分别为62 000和48 000;C为核蛋白,相对分子质量35 000。E1与血凝有关,E2作用尚不清楚;此病毒仅一个血清型,与披膜科的60多种病毒都无抗原交叉。

人是本病毒的唯一宿主,猴、雪豹、大鼠、地鼠、家兔等可实验室感染,但仅狒狒受染后出现皮疹。此病毒可在细胞培养中繁殖,但常无病变出现,需用其他致病变的病毒攻击、观察干扰现象的存在来证实本病毒的存在。此病毒能凝集多种动物的红细胞,如雏鸡、鸽、鹅、绵羊、猴、豚鼠、火鸡、猫、家兔、大鼠、田鼠、小鼠、人等。

该病毒感染后,IgD、IgE抗体迅速上升,持续于高水平至少2个月。IgM于发疹后1~2d出现,约10d达高峰,1个月起转阴。IgG抗体出现较IgM稍晚,1~2个月达高峰,以后缓慢下降,多维持终身。

风疹病毒的实验室诊断主要有以下几个方面。

血凝抑制试验(HI)

  1. 风疹血凝素的制备 以风疹病毒感染Vero细胞,置37℃、7d以上,待出现3+CPE时收获,反复冻融3次,以Tween-80与乙醚处理,滴定效价后-20℃保存备用。
  2. 细胞 选用鸽、鹅或1日龄雏鸡红细胞。
  3. 血清处理 人血清中存在非特异性抑制物或凝集物,故血清需进行预处理。抑制物多为β脂蛋白,可用硫酸葡聚糖-氯化钙、肝素-氯化锰、白陶土等除去。
  4. 血清稀释 血清以生理盐水1∶1稀释后,56℃灭活30min后备用。
  5. 试验方法 取U形反应板一块。

①第1、2及第9孔加1∶2稀释的血清25μl。第2~9孔加生理盐水25μl;第9孔为血清非特异性凝集对照。

②第2~8孔倍比稀释血清。

③第1~8孔各加2U血凝素25μl,第9孔加生理盐水25μl。

④每孔加1%鹅红细胞25μl。振荡后置37℃1h。

⑤待红细胞对照下滑成泪滴状时读取结果;红细胞下滑与对照完全相同者为完全抑制;完全抑制的血清最高稀释度即为抗体效价,血清对照有凝集时不能判为阴性。

目前HI试验主要用于人群抗体水平调查和疫苗免疫效果的观察。用于患者诊断需双份血清,不能达到早期诊断的目的,且敏感性不如ELISA法高。单份急性期血清用二巯基乙醇(2-ME)处理,用HI法测定处理前后抗体效价的变化,或以金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)吸收血清中的IgG,再测定血清中的IgM抗体。

间接ELISA法测定抗风疹病毒IgG抗体

  1. 用pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释风疹病毒抗原与对照抗原。
  2. 于40孔酶标反应板的单排孔和双排孔分别加入0.1ml/孔,4℃过夜后备用。
  3. 加入连续4倍稀释的待测血清(1∶20~1∶1280),依次分别加入抗人IgG酶结合物与底物等。显色后判定结果。<1∶20为阴性。本方法可用于个体或群体抗体水平测定;用于诊断患者需双份血清,第一份在出疹4d内采集,第二份≥15d,同时同一板上测定,相差≥4倍即可诊断。血清无需处理,较HI法方便、敏感。

捕获ELISA法测定抗风疹病毒IgM抗体

  1. 以抗人μ链单克隆抗体包被酶标反应板,4℃过夜后备用。
  2. 加入待测血清(1∶200)2孔,37℃1h,洗板后分别进入风疹抗原和正常细胞对照抗原各1孔,37℃1h,洗板后加入酶标记兔抗风疹病毒抗体,再37℃1h,洗板后加入底物显色。用酶标仪测定吸光度值。以P/N≥2.1判为阳性。根据风疹病毒IgM的动态,出疹后4~5d诊断率可达100%,IgM抗体高峰期在10d左右,采血时间以出疹7~20d为佳。

风疹病毒RNA的PCR测定

一、引物设计

选择编码糖蛋白的基因序列中的一段保守区域作为靶序列,探针被设计在编码主要抗原决定簇基因序列中,定位于扩增的靶序列内里。

5′-CAACACGCCGCACGGACAAC-3′

5′-CCACAAGCCGCGAGCAGTCA-3′

二、标本处理

精液、血清、尿液等液体标本可直接用苯酚-氯仿抽提,用乙醇沉淀,蒸馏水溶解后用于PCR扩增,组织标本需绞碎,水溶后再用上法提取(详细方法请参阅聚合酶链反应一节)。

三、RT-PCR

  1. 逆转录:20μl的逆转录反应体系中含1×逆转录缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.3;75mmol/L KCl;10mmol/L DTT;3mmol/L MgCl2)dNTPs各0.5mmol/L,上游引物,M-MLV逆转录酶200U,RNA酶的蛋白抑制剂40U及待测RNA样品5μl。测定样品的同时做1份正常阴性对照以排除假阳性。37℃反应1h,95℃5min终止反应。
  2. PCR:反应体系25μl含1×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.3;50mmol/L KCl;1.5mmol/L MgCl2;100ng/ml明胶),dNTPs各125μmol/L,二条引物各1μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,逆转录产物5μl,进行扩增反应;94℃1min,54℃1min,72℃1min,进行35个循环,最后一次循环在72℃延长5min,以保证链延伸反应的彻底进行。
  3. 扩增产物的电泳分析:20μl产物加入1/10体积的终止缓冲液,在1%琼脂糖-溴乙锭电泳后于紫外灯下观察结果,本法的扩增产物约为311bp。

除HI法测定风疹病毒血凝素抗体以外,其他几种方法均已有商品试剂盒出售,按说明书操作即可。

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