精浆游离mRNA的分离与特点

国外对游离mRNA的研究开始于1999年,两个小组在肿瘤患者血浆中检测肿瘤来源的mRNA,一年后,Poon等在孕妇血浆中检测到胎儿表达的mRNA。目前,对于游离mRNA的研究成为一个新的热点,除血浆外,已在唾液、支气管灌洗液、尿液、精浆等体液发现有游离mRNA的存在,其中以血浆和唾液中游离mRNA研究相对较多。研究表明,尽管外周血和唾液中含有丰富的RNA酶,但游离于细胞外的mRNA确实存在,其来源尚不十分清楚,推测可能是细胞死亡后释放或活细胞分泌至胞外,并可能与其他物质结合,增加其稳定性,逃避RNA酶的降解作用。由于游离mRNA对其来源器官基因表达的全面代表性,加之分子生物学技术的快速、敏感而准确,及其快速发展趋势和前景,游离mRNA被认为在疾病诊断、法医鉴定、产前诊断等方面具有很好的应用前景。例如,可通过检测肿瘤来源的异常游离mRNA来诊断肿瘤,通过检测孕妇血浆中胎儿源性游离mRNA进行产前诊断等。

2009年,我们首次报道了精浆游离mRNA(cell-freeseminal mRNA,cfs-mRNA)的分离及一般特征,小结如下。

cfs-mRNA的分离

精浆也许是人体液中分离RNA最有挑战性的液体,主要是由于成分复杂,如含丰富蛋白和多糖,这些均不利于RNA的提取,以下方法是先用TRIzol LS粗取cfs-mRNA,然后再进一步用RNeasy Kit纯化。

一、器材准备:低温高速离心机,连续可调加样器(1ml,200μl,20μl)及相应加样枪头(RNase-free)。

二、试剂准备:TRIzol LS,RNeasy Kit,氯仿,异戊醇,无水乙醇。

三、实验步骤

  1. 精液液化后离心获取精浆,为避免高速离心导致细胞破裂而有其他RNA“污染”,建议两步离心法(室温):1600g,10min,然后收集上清液进行第二次离心,16 000g,10min,小心取上清液即为精浆。
  2. 按4∶5(v/v)比例将离心后精浆与TRIzol LS混和,室温静置5min。
  3. 加1/5倍于混和液体积的氯仿,剧烈振荡15s,室温静置5min;12 000g于4℃离心10min。
  4. 取上层无色清亮液体,勿吸取有机层物质,按1∶1(v/v)与异丙醇混合,吹打混匀后室温静置10min。
  5. 12 000g,4℃离心10min,去上清液,RNA沉淀用75%乙醇(用RNase-free水配制)洗涤2次后溶解于100μl RNase-free水中。
  6. 100μl RNA加入350μl RLT工作液(RNeasy Kit),充分混匀;加入250μl无水乙醇,充分混匀后加到纯化柱中,8000g离心15s。
  7. 加700μl缓冲液RW1到RNeasy Kit的吸附柱中。轻轻旋紧管盖,8000g于室温离心15s,对旋转柱膜进行清洗。
  8. 弃去收集管中滤液,加入500μl RPE工作液,对旋转柱膜进行清洗。8000g离心15s;
  9. 弃去收集管中滤液,加入500μl RPE工作液,对旋转柱膜进行清洗。8000g离心2min;
  10. 弃去收集管中滤液,将纯化柱换入一个新收集管中,12 000g离心1min;
  11. 将RNeasy旋转柱置于新的1.5ml收集管(RNase-free)中。轻轻旋紧管盖,在最大速度下离心1min。
  12. 将纯化柱换入一个新的1.5ml EP管(RNase-free)中,在纯化柱膜中间加25μl RNase-free水,室温放置1min,12 000g离心1min;洗脱得到RNA。置-70℃保存。

cfs-mRNA的特点

一、含量与种类

对10例精液参数正常标本分析,cfsRNA含量范围为每毫升精浆0.87~3.64μg,平均含量为1.75± 0.92μg/ml。表达谱芯片结果显示,至少有12 000个基因mRNA存在于精液参数正常男性cfsmRNA中。

二、稳定性

由于精液中含有大量的RNA酶,在人精浆中加入大鼠睾丸RNA,15s后就已检测不到大鼠β-actin。但通过时间变化来分析cfs-mRNA的稳定性,与0min时间β-actin mRNA的量相比,β-actin mRNA的5′端、3′端及中段在24h内均无明显减少,说明精浆中β-actin mRNA是稳定的。与0min的时间DDX4 mRNA的量,DDX4mRNA的5′端在24h内稳定,而DDX4mRNA中段的含量在90min时开始慢慢减少,24h后已经降解到最初的25.8%。DDX4mRNA 3′端含量在20min已降到了27.4%,90min时已检测不到mRNA 3′端。这些结果表明,cfs-mRNA的稳定性是相对的,且依不同基因的mRNA而异,但5′端比较稳定。进一步对其存在形式的研究表明,cfs-mRNA主要被包裹于微小体中,而逃避RNA酶的降解。

三、完整性

利用RT-PCR,可以从cfs-mRNA中扩增出完整的基因mRNA,所以,虽然部分可能以降解形式存在,但仍有完整的cfs-mRNA。

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