精浆游离DNA的分离与特点

精浆游离DNA的分离

目前还没有专门用于提取精浆游离DNA(cell-freeseminal DNA,cfsDNA)的商品化试剂,以下方法可以快速有效的回收cfsDNA。

器材准备:高速离心机,涡旋振荡器,连续可调加样器(1ml,200μl,20μl)及相应加样枪头,聚丙烯膜DNA纯化柱。

试剂准备:

  1. DNA结合缓冲液:6mol/L盐酸胍,10mmol/L尿素,10mmol/L Tris-HCl,20%Triton X-100,pH 4.4。
  2. 洗涤缓冲液:20mmol/L NaCl,2mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,80%乙醇。
  3. 洗脱缓冲液:10mmol/L Tris-HCl,PH 8.0,20mg/mL RNase A。
  4. 蛋白酶K:20mg/ml。

提取步骤:

  1. 精液液化后离心获取精浆,为避免高速离心导致细胞破裂而有其他DNA“污染”,建议两步离心法(室温):1600g,10min,然后收集上清液进行第二次离心,16 000g,10min,小心取上清液即为精浆。
  2. 取800μl精浆,与等体积DNA结合缓冲液和8μl蛋白酶K(20mg/ml)混合。
  3. 70℃孵育10min,加入400μl异丙醇,使用涡旋振荡器混匀。
  4. 将混合液转移到聚丙烯膜DNA纯化柱,8000g离心15s。
  5. 弃去滤过液,加入500μl洗涤缓冲液加至DNA纯化柱,8000g离心15s。
  6. 弃去滤过液,12 000g离心1min,在吸附柱膜上加入40μl洗脱缓冲液,将吸附柱放入1.5ml新收集管,12 000g离心1min,洗脱得到DNA。

cfsDNA的特征

一、浓度

通过紫外分光光度计对11例精液参数正常男性和9例非梗阻性无精子症患者cfsDNA进行浓度检测,发现精液参数正常男性cfsDNA浓度为1.34±0.65μg/ml,而非梗阻性无精子症患者cfsDNA浓度为2.56±1.43μg/ml。比健康人群其他体液的游离DNA浓度高得多,如血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)1.8~35ng/ml、羊水9.4ng/ml、尿液0.3~200ng/ml,非梗阻性无精子症患者cfsDNA浓度约为正常男性2倍,这可能与无精子症患者精子发生过程中生殖细胞出现明显的凋亡有关。

二、片段大小

cfsDNA在1%琼脂糖凝胶上进行电泳,片段大小为180bp至15kb,有时可以看到明显的凋亡“梯子”条带的特征,其广泛的DNA分子分布范围,为男性生殖系统疾病DNA表观遗传学及传统遗传学异常的无创检测提供了保证。通过常规PCR扩增出1450bp大小sY114位点,表明cfsDNA也可以用于较大片段DNA扩增。

三、来源和稳定性

对精浆低速离心后进行高速离心及过滤两种不同处理方法,比较其提取cfsDNA的含量和稳定性差异,发现cfsDNA含量无明显差异,精浆37℃孵育24h后cfsDNA含量只轻微下降。表明这些高浓度cfs-DNA与高速离心时细胞裂解及过滤无关,可能由凋亡、坏死的生殖细胞及分泌精浆的器官释放,cfsDNA电泳出现的明显凋亡条带也证实了cfsDNA部分来自于凋亡细胞;而cfsDNA 37℃孵育24h只有轻微降解,说明精浆cfsDNA稳定。

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