精浆游离miRNA的分离与特点

精浆中不仅有丰富的mRNA,还含有多种miRNA,以及piRNA。上述提取cfs-mRNA的方法也可以用于提取精浆游离miRNA(cell-freeseminal miRNA,cfs-miRNA),但是,由于RNeasy Kit主要用于纯化mRNA,纯化柱对于小分子的miRNA吸附并不强,所以,得到的miRNA含量相对较低。

cfs-miRNA的分离

主要介绍改良的TRIzol LS法用于提取cfs-miRNA。

器材准备:低温高速离心机,连续可调加样器(1ml,200μl,20μl)及相应加样枪头(RNase-free)。

试剂准备:①Trizol LS,PEG20000,氯仿,异戊醇,无水乙醇。②配制TRI试剂缓冲液:0.15%NaCl,1%SDS,2.5mmol/L EDTA,0.1mol/L Tris-HCl,pH 为8.0。

实验步骤:

  1. 精液液化后离心获取精浆,为避免高速离心导致细胞破裂而有其他RNA“污染”,建议两步离心法(室温):1600g,10min,然后收集上清液进行第二次离心,16 000g,10min,小心取上清液即为精浆。
  2. 取200μl精浆,加入250μl 1×TRI试剂缓冲液和9mg PEG20 000,使其终浓度为2%,充分混匀。
  3. 于室温下放置10min,然后12 000g,4℃离心10min。
  4. 取上清液400μl,加入800μl TRIzol LS吹打混匀至少30s,室温静置5min。
  5. 12 000g,4℃离心10min,取上清液1ml,加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀15s,室温静置5min。
  6. 12 000g,4℃离心15min。
  7. 取上层无色清亮液体600μl,勿吸取有机层物质,按体积比1∶1与异丙醇混合,吹打混匀后室温静置10min。
  8. 12 000g,4℃离心10min,去上清液,RNA沉淀用75%乙醇1ml(用RNase-free水配制)洗涤。
  9. 7500g,4℃离心5min。去上清液,通风干燥后将RNA沉淀溶解于15μl RNase-free水中。
  10. 如果需要进一步提高纯度,可以进一步用miRNA纯化的试剂盒进行。

cfs-miRNA的特点

种类:我们对精液参数正常标本cfs-miRNA进行测序,reads数在100以上的piRNA有261种,miRNA有187种。表明cfs-miRNA含有丰富的miRNA和piRNA。

稳定性:cfs-miRNA具有很好的稳定性,室温24h后含量基本没有变化。但是,与cfs-mRNA不同,大部分cfs-miRNA并不存在于微小体中,而是可能与蛋白结合在一起形成复合体而逃避RNA酶的降解。

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