miRNA与肿瘤恶液质

在上文中,我们已经得知miRNA与癌细胞代谢密切相关,目前已经发现的这些相关性可能只是冰山一角,需要更多的研究来阐明两者之间的关系,但毫无疑问的是miRNA直接影响癌细胞生物学活性,并与恶液质的发生发展密切相关,下文将详细回顾目前此领域的相关研究。

microRNA与肌肉萎缩

肿瘤恶液质以骨骼肌消耗,瘦体组织减少,体重下降,机体蛋白储备减少为特点。骨骼肌消耗是肌肉蛋白合成下降和分解代谢加速的结果,众多复杂因素参与这一过程。目前研究认为影响肿瘤恶液质肌肉萎缩的主要信号途径包括:胰岛素/IGF-1/ PI3K/Akt/Akt途径、肌肉抑制素途径、TNF-α/NF-κB途径。影响肌肉增殖和分化的miRNA可分为两种类型,肌肉组织特异型miRNAs(myomiRs)和非肌肉特异型miRNAs。现在我们从了解miRNA与相关信号通路的关系来探讨miRNA与肌肉生成和萎缩的关系。

IGF/PI3K/Akt信号通路是肌肉生成或肌肉肥大的正向调节通路,它通过增加蛋白合成和降低蛋白分解来增加肌肉组织量。研究表明肿瘤患者中普遍存在胰岛素抵抗,当机体处在胰岛素抵抗和IGF-1缺乏时,此通路将受到抑制,同时启动蛋白水解酶体系统,导致肌肉蛋白降解。现在发现这一信号通路直接或间接受到miR-1、miR-133、miR-206 或miR-125b下调并受到miR-23a和miR-486上调。肌肉特异性miR-1通过作用于IGF-1来调节肌肉细胞生长和分化。研究表明miR-1和IGF-1蛋白水平在C2C12细胞的分化过程中呈负相关,因为IGF-1可以使Foxo3a转录因子失活来下调miR-1的表达。除此之外,有研究表明将miR-1和miR-133a转染到新生小鼠心肌细胞中可以消除IGF-1诱导的肌肉肥大。另外一项针对myomiR的研究中,miR-206通过作用于IGF-1mRNA的3′UTR来实现其调节作用,在体内miR-206水平的减少可以明显增加IGF-1mRNA的表达水平。另有研究者表明IGF-1受体(IGF-1R)受到miR-133的调节,他们证实miR-133可与IGF-1R的3′UTR结合。C2C12细胞中miR-133水平的增加可以显著抑制IGF-1R蛋白在转录后的表达水平。miR-133过度表达或敲除IGF-1R可以降低Akt的磷酸化,这样就阻碍了IGF-1/PI3K/Akt信号通路的激活。研究表明miR-125b可负性调节成肌细胞的分化,而在肌肉生成过程中miR-125b的水平下降。miR-125b在成肌细胞和肌肉再生过程中作用于IGF-2靶点,并受到mTOR的负性调控。

通过激活Foxo转录因子可激活泛素-蛋白酶体系统,降低IGF-1通路的活性,可加速肌肉蛋白的降解。降低Foxos的磷酸化可以促使这些介质转运到细胞核内,在那里它们可以直接调控那些诱导肌肉萎缩的相关基因的表达,其中包括肌肉特异性E3连接酶,MAFbx/Atrogin-1和MuRF-1。研究报道miR-486抑制Foxo1和PTEN表达和活性。miR-486下调PTEN,从而增加pAkt,另外也导致Foxo1蛋白翻译下降。此外,慢性肾病模型鼠肌肉中的miR-486水平增加可抑制MAFbx/Atrogin-1和MuRF-1,并且可以增加肌肉的量。Dey等研究表明miR-486通过抑制Pax7来增加卫星细胞分化。这些研究表明,miR-486调节肌肉萎缩程序的几个方面,并因此成为一个潜在的治疗药物。miR-486在杜兴肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者中下降,PTEN和Foxo1被证实是miR-486的作用靶点。在同一研究中,研究者还发现miR-486过度表达在体内可损害肌肉再生。这一结果表明miR-486在肌肉纤维再生过程中可改变细胞周期动力学。miR-17-92可抑制PTEN表达,小鼠中过度表达的miR-17-92可以导致心肌肥大;然而,miR-17-92在骨骼肌萎缩中的作用目前并没有研究。

几项研究表明,miR-23a是一个肌肉萎缩/肥大相关的miRNA,但是这一结论尚有争议。在肌肉萎缩过程中MAFbx/Atrogin-1和MuRF-1,E3连接酶等均明显的被诱导生成,并调节与肌肉萎缩的相关蛋白合成和降解的改变。Wada等研究表明miR-23a通过依赖3'UTR的方式抑制MAFbx/ Atrogin-1和(或) MuRF-1的翻译。进一步研究表明,异常表达的miR-23a能够保护肌肉不萎缩。在miR-23a的转基因小鼠中还发现miR-23a能拮抗糖皮质激素诱导的骨骼肌萎缩。另有在心肌肥大的报道中,miR-23a是促肌肉肥大的miRNA。使用异丙肾上腺素和醛固酮刺激处理来诱导心肌肥大的模型中,miR-23a表达上调。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFATc)3可与miR-23a的启动子相结合并增加其转录。最近研究还发现miR-23a抑制肌肉生成的分化。miR-23a直接作用于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因包括MHC-1、MHC-2、MHC-4的3′UTRs。有趣的是,成熟miR-23a的表达水平与鼠骨骼肌肌肉生成过程呈负相关。另外研究发现,一次急性的可耐受性肌肉训练可以降低84%的miR-23表达。此外,miR-23负性调节PGC-1a,miR-23水平的降低与PGC-1a的mRNA和PGC-1a下游数个蛋白靶点水平增加有关,其中包括5-氨基乙酰丙酸合酶(5-aminolevulinate synthase,ALAS)、柠檬酸合成酶(citrate synthase,CS)和细胞色素C(cytochromec)的mRNA。

肌肉抑制素(Myostatin)属于TGF-β超级家族中的一员。与IGF/Akt信号通路相比,肌肉抑制素途径是骨骼肌的负性调剂者。1997年McPherron等首次阐明肌肉抑制素在骨骼肌中的重要作用。他们通过培育已经敲除肌肉抑制素基因的小鼠,结果发现骨骼肌总量增加两倍,主要是因为肌肉纤维大小和肌肉纤维数量均明显增加。这项开创性的研究让我们更加深入的了解牛、羊、狗等先天性即可发生肌肉抑制素基因突变的动物,它们具有肌肉过度增长的机制。更为重要的是,在骨骼肌增加的人类中也发现肌肉抑制素基因突变的现象。随后的研究进一步证实:肌肉抑制素在肌肉生成中起重要作用。研究者们在小鼠中给予肌肉抑制素结果诱导了骨骼肌的萎缩。在肿瘤恶液质、心衰、HIV、慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)、慢性梗阻性肺病和老龄化中均发现肌肉抑制素表达增高,并与肌肉丢失密切相关。目前普遍认为,抑制和(或)逆转肌肉抑制素功能是治疗神经肌肉疾病、肿瘤和老年化等情况下肌肉丢失的重要方式。

肌肉抑制素信号通路通过丝氨酸/苏氨酸激酶受体,包括活化素受体ⅡB(activin type ⅡB receptor,ActRⅡB)和活化素样受体激酶(activin receptor-like kinase,ALK) 4或ALK5来传递细胞内信号。肌肉抑制素与它的受体结合以后,ALK4/ ALK5激活Smad2和Smad3。Smad2/3磷酸化后能够形成复合体,并与Smad4结合。然后,这一复合物转移到细胞核内调节靶基因的转录。在早期的研究中,卫星细胞一度被认为是肌肉抑制素缺乏导致肌肉肥大的主要来源,因为肌肉抑制素可抑制卫星细胞活力和自我更新。后来几项研究表明肌肉抑制素直接影响肌肉纤维蛋白的合成。最近的研究表明卫星细胞很少程度上是通过抑制肌肉抑制素来促进骨骼肌肥大。

miR-27a通过直接抑制肌肉抑制素增加肌肉细胞增殖。脊椎动物的肌肉抑制素的3′UTR包含有与miR-27a和miR-27b结合的序列。另有研究表明,miR-27b的表达可显著抑制几乎一半的肌肉抑制素的3′UTR-荧光素酶活性。miR-27b突变可以明显增加肌肉抑制素3′UTR的活性。炎症因子肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导因子(TNF related weak inducer of apoptosis,TWEAK)通过下调miR-27a 和miR-27b来诱导肌肉萎缩。在肌肉抑制素敲除小鼠中,MyomiRs包括miRNA-1、miR-133和miR-206表达明显增加,此外,Myf5和MEF2A表达增加。

miR-29最初发现能够通过抑制YY1和Akt3来加速肌肉的分化。miR-29也能够减弱TGF-β对肌肉分化的抑制作用,而miR-29也处在TGF-β和Smad3的调控之下。有趣的是,研究表明在培养的细胞株中miR-29作用于PTEN靶点来激活Akt通路。Goodman等最近研究表明在体内转染Smad3降低Akt/mTOR活性并诱导肌肉纤维萎缩,还发现通过降低miR-29启动子的活性可增加PTEN mRNA翻译。然而肌肉抑制素调节miR-29的表达和功能,它在调节骨骼肌量中的作用仍然需要进一步阐明。

最近发现敲除肌肉抑制素的小鼠中miR-486的表达明显增加。肌肉抑制素通路通过Smad3蛋白调节miR-486的转录来抑制miR-486的表达。像上面所述,miR-486作用于PTEN靶点增加Akt活性,因此,几种miRNAs包括miR-486能够通过激活Akt通路来抑制肌肉抑制素,诱导肌肉的肥大。

除此以外,另外三个相关的MyomiRs:miR-208a、miR-208b、miR-499均由肌凝蛋白基因(miR-208a/Myh6、miR-208b/Myh7、miR-499/Myh7b)内含子编码。miR-208a的表达具有心脏特异性,而miR-208b和miR-499在心脏和慢抽搐肌肉中表达。在骨骼肌中,miR-208b和miR-499促进慢抽搐肌肉纤维的形成,因为这些miRNA通过抑制Sox6、Pur-β和Sp3来增加慢肌基因的表达。相应的,敲除miR-208b和miR-499的小鼠可导致比目鱼肌中慢肌纤维的丢失。最近的研究表明,通过荧光素酶活性检测来了解miR-208a、miR-208b和miR-499与肌肉抑制素3′UTR之间的直接关系。虽然miR-208a通过降低肌肉抑制素表达来诱导心脏肥大,但是miR-208b和miR-499是否潜在诱导骨骼肌肥大并没有被描述。研究表明通过增加营养的摄入可以增加人类股部侧方肌肉中miR-208b和miR-499的表达,同时降低肌肉抑制素的表达。因此,需要进一步证实miR-208b和miR-499在调节骨骼肌量中的功能。

肿瘤患者伴随机体全身性炎症反应,血清中各种炎症因子大量增加,TNF-α可以通过激活NF-κB诱导MuRF-1的表达,引起肌肉蛋白降解;也可以抑制MyoD等肌肉分化生长因子mRNA水平阻碍骨骼肌的分化,影响肌肉损伤修复。TWEAK是导致肌肉丢失的主要细胞因子。TWEAK抑制几个miRNAs的表达,包括miR-23b和肌肉特异性miR-1-1、miR-1-2、miR-133a、miR-133b和miR-206。TWEAK通过抑制PI3K/Akt途径和激活泛素-蛋白酶系统和NF-κB来诱导骨骼肌萎缩。

综上所述,miRNA在肿瘤肌肉生成中发挥重要调节作用,部分miRNA可以作为潜在的药物治疗靶点。

miRNAs与脂肪消耗

肿瘤患者脂肪组织消耗常发生于厌食症状出现之前,并首先发生在躯干部位,随后累及四肢,这种脂肪消耗不同于饥饿所致脂肪丢失,故普通营养支持不能逆转这一病理进程。肿瘤恶液质患者的脂肪消耗远远快于瘦体组织丢失,脂肪细胞代谢紊乱同时伴有大量脂肪因子的释放,导致高血脂,胰岛素抵抗。脂肪的过度消耗后,机体处于能量-蛋白质负债,只能动员内脏蛋白质来参与氧化供能维持生命需要,最终导致脏器功能不全。因此脂肪消耗与恶性肿瘤患者预后密切相关。

脂肪细胞的脂肪分解作用主要受到三种激素及相应受体的调节控制:儿茶酚胺/肾上腺素受体(adrenergic receptor,ADR)ADRB1、ADRB2、ADRB3、ADRA2C,心房钠尿肽/心房钠尿肽受体A(natriuretic peptide receptor A,NPRA),胰岛素/胰岛素受体(insulin receptor,IR)。其中ADRB1、ADRB2、ADRB3、NPRA介导脂肪分解刺激信号;IR、ADRA2C则介导抑制信号。脂肪细胞中甘油三酯的水解受到两个脂肪分解酶的调节:甘油三酯酸水解酶(adiposetriglyceridelipase,ATGL),由PNPLA2编码;甘油三/二酯激素敏感脂肪分解酶(tri/diglyceride hormone-sensitive lipase,HSL),由LIPE编码。HSL是催化脂肪分解最终环节的关键酶,最新研究发现HSL过度表达及活性增强是引起肿瘤恶液质脂肪分解通路激活的关键机制。ATGL激活脂肪分解需要共同因子比较基因识别(comparative gene identification,CGI)-58,由ABHD5编码。除了脂肪分解酶,脂肪小滴外覆蛋白也是脂肪分解的重要调节者。脂滴包被蛋白(perilipin,PLIN)家族包括磷蛋白PLIN1是脂肪小滴外覆蛋白的主要组成部分。这些脂肪分解调节基因表达的变化与恶液质明显相关。

2010年,Dahlman等检测了13例肿瘤恶液质和14例肿瘤对照患者皮下脂肪组织的基因表达谱,发现恶液质脂肪丢失程度主要与调节能量代谢、细胞骨架及细胞外基质的基因表达变化有关,其基因表达谱改变与肥胖症中发生的变化相反,提示肿瘤恶液质脂肪消耗在相当程度上与肥胖症的发生机制相通。肿瘤恶液质脂肪消耗的发生机制极为复杂。目前针对肿瘤恶液质患者脂肪消耗相关机制的研究仍然比较少。Thorhallur等研究26例有或不具有恶液质的肿瘤患者中成熟S.C.脂肪细胞和分化的脂肪前体细胞。激素诱导的脂肪分解和脂肪分解调节基因的表达均受机体构成和体内脂肪分解活性(禁食血浆甘油或游离脂肪酸)决定。机体脂肪下降40%和体内脂肪分解活性在肿瘤恶液质的患者中两倍增加。在成熟的脂肪细胞中,儿茶酚胺和利钠肽刺激的脂肪分解功能在恶液质的患者中呈2倍到3倍增加。这些作用通过抑制HSL限速酶来完全抵消。在恶液质中HSL 的mRNA和蛋白的表达水平和分别增加50%和100%,这些与体外脂肪分解刺激强烈相关。在恶液质中成熟脂肪细胞中胰岛素的抗脂肪分解功能和分化的脂肪前体细胞刺激脂肪分解功能并没有改变。因其他原因而非肿瘤恶液质导致的体重下降患者脂肪细胞的脂肪分解作用没有改变。脂肪细胞的脂肪分解在肿瘤恶液质中明显增加,推测最可能是因为脂肪细胞的HSL功能和表达增强所致,选择性抑制这种酶可以阻止肿瘤患者脂肪丢失。

目前发现miRNA参与脂肪代谢,参与脂肪细胞分解的多项功能。Kulyté A等选择10例伴有恶液质的消化道肿瘤患者的腹壁脂肪组织和11例没有恶液质的腹壁脂肪组织,检测其中的miRNA表达差异。在体外实验中证实分化的脂肪细胞中miRNA过度表达或抑制脂肪分解作用。脂肪组织中有超过116个miRNA,其中5个miRNA明显表现为恶液质相关性。其中4个(miR-483-5p/-23a/-744/-99b)下调,只有miR-378在恶液质中明显上调。miR-378在脂肪组织中表达,与脂肪细胞中儿茶酚胺刺激的脂肪分解有很强的正相关性。这种相关性很可能是因为miR-378在人类脂肪细胞中过度表达增加儿茶酚胺刺激的脂肪分解。除此以外,抑制miR-378表达消除脂肪分解的刺激作用和减弱下调一系列脂肪分解调节基因编码的物质:LIPE、PLIN1和PNPLA2的表达。增加miR-378的表达通过影响脂肪细胞的脂肪分解作用在肿瘤恶液质相关的脂肪组织丢失中发挥病因学的作用。在不同的实验模型中,miR-378在脂肪生成过程中明显增加,并刺激脂肪生成基因的表达,提示它在脂肪细胞生理学中起重要作用。抑制miR-378刺激机体能量消耗和脂肪酸氧化,这些作用与肝脏的基因表达改变有关。这些结果提示miR-378在不同器官中均在脂肪代谢中起补充调节功能。这些可能表现为体重调节途径,通过改变能量平衡或体重改变,因为有报道称miR-378下调肥胖者的脂肪组织。有趣的是,miR-378被认为是胃癌中的一种特殊的肿瘤标记物。

Silvia等在体外的分化的脂肪细胞培养过程中使用TNF-α和甘油作为处理条件,经过48小时处理后,目前已知的在脂肪组织中存在的11个miRNAs均过度表达。当miR-26a和let-7d下降,miR-145增加甘油的释放和TNF-α的分泌。进一步研究发现miR-145刺激脂肪分解和促进TNF-α分泌。miR-145过度表达可以上调TNF-α的表达和分泌,同时也增加甘油的释放。除此以外,miR-145通过激活p65(NF-κB复合体的成员)使TNF-α产生增加。miR-145下调蛋白酶ADAM17的表达,导致TNF-α膜结合片段增加,这是TNF-α生物活性的主要形式。miR-145过度表达增加激素敏感脂肪酶的色氨酸残基磷酸化并降低磷酸二酯酶3B的mRNA表达,这也在人类脂肪细胞经TNF-α处理的过程中发现。推测miR-145通过多条机制涉及增加TNF-α的产生和生物过程来调节脂肪细胞的脂肪分解作用。

miRNA与恶液质的相关症状

高分解代谢和高能量消耗是恶性肿瘤患者营养物质代谢中的主要特点。在代谢过程中,肿瘤细胞可产生大量的色氨酸,导致循环中色氨酸水平增高,并透过血-脑屏障,进一步增加脑脊液中色氨酸含量,而色氨酸作为5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的前体,可以激发患者下丘脑产生的较正常人体更高水平的5-HT,过多的5-HT则可作为神经递质也反作用于下丘脑的5-HT系统,同时也作为神经递质作用于消化道,引起厌食、消化功能紊乱等症状。那么miRNA与肿瘤患者厌食有着什么样的关系呢?

Mercader等在厌食小鼠模型anx/anx中检测miRNA的作用,结果发现,在anx/anx的下丘脑中预计是miRNA靶点的mRNAs明显上调,而在anx/ anx脑皮质中预计是miRNA靶点的mRNAs明显下降,这表明miRNA在anx/anx脑部的这两个区域不能调控靶基因。经仔细研究这些mRNA转录小组,结果确定了5个microRNA诱导的沉默复合物(microRNA induced silencing complex,miRISC)基因明显上调,包括Dgcr8和Fmr1和Ago2。这些结果表明anx/anx小鼠中miRNA表达的改变和它在炎症和肿瘤相关的厌食疲劳中是一致的。上述研究提示miRNA参与了肿瘤恶液质厌食等症状的发生。目前关于这一领域的研究仍然很少,需要更多的研究来阐明两者之间的关系。

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