精液准备
精子除了来自于体外排精外,还可以通过显微外科手术获取附睾中精子和睾丸组织中精子。此外还可用睾丸组织中长形精子细胞进行显微授精。不同来源的精子处理方法也不同。
少弱精子症可用密度梯度离心法处理,严重少弱精子症可用mini密度梯度离心法处理。经皮附睾穿刺时,先于注射器中吸取1ml培养液,吸取附睾液后连同培养液一起注入培养皿,观察有无精子,若精子浓度尚可,则行mini密度梯度离心法,否则直接离心取沉淀即可。取睾丸精子时,则需在培养皿中预先加入培养液,放置睾丸组织后,用注射器将生精小管撕碎,再将混悬液吸入离心管中离心取沉淀备用。
卵子的准备
将经37℃、5%CO2培养箱培养4h的卵冠丘复合物吸入含有透明质酸酶溶液的培养皿中,用吸管连续吹打卵冠丘复合物,以除去卵子外层的颗粒细胞,并严格控制卵子在酶中的时间在30s之内。然后将卵子快速移入培养液中,冲洗数次,再用内径约为130μm的管口光滑的巴氏管反复吹打,以除去卵子周围残存的颗粒细胞。将卵子置于倒置显微镜下进行质量及成熟度的评估,确定第一极体是否存在,将选择好的卵子转移到准备好的培养皿中,供ICSI用。
ICSI操作
在倒置显微镜的恒温载物台上,安装好持卵针和穿刺针,调节显微镜注射装置,使其可灵活地控制吸收精子,在低倍显微镜下依次调节持卵针和穿刺针的角度和位置,两个针头相对并与载物台平行。
从Petri皿中央微滴中选择单个形态正常的精子,将吸有少量PVP的穿刺针在精子的尾部1/3处摩擦精子,使精子制动,或在其尾部中段迅速制动,然后将精子吸回穿刺针,吸时尾部在先。移动Petri皿,以便在液滴中发现卵子,用持卵针轻轻拨动卵子,使其第一极体位于6点或12点处,以免穿刺时损伤纺锤体。持卵针轻微负压吸住卵子,穿刺针在3点的位置上推进,穿过透明带和卵膜,进入卵母细胞质内,缓慢将精子注入卵细胞内,应尽量减少进入卵母细胞中的PVP液。轻轻退出穿刺针,退针时,将持卵针保持原固定位置,然后松开持卵针。大多数情况下,裂孔边缘呈漏斗状,指向卵细胞内,提示卵子的质量较好。然后重复上述选精及注射的过程直至所有处于减数分裂Ⅱ期的卵子均被注射完毕。将所有注射过的卵子用培养液冲洗数次,再移入新的培养皿内继续培养。