精子计数检查

每次射精的精子总数和精子浓度(以往常用的术语“精子密度”,字义为每单位体积的精子质量,使用“精子浓度”来表述每单位体积的精子数量更为合适)与妊娠时间和妊娠率存在联系,并且可以预测受孕。对于正常射精,当男性输精管道畅通且禁欲时间短的时候,精子总数与睾丸体积相关,可以用来衡量睾丸产生精子的能力和男性输精管道畅通的程度。而精子浓度虽然与受精率和妊娠率相关,但易受精囊和前列腺分泌液量的影响,不是衡量睾丸功能的特异性指标。因此,每次射精的精子总数更具有意义。

每次射精的精子总数可以通过测定精液的精子浓度和体积来计算,所以精确的体积测量和精准的浓度检测是计算精子总数的基础。

改良Neubauer血细胞计数板

WHO推荐使用100μm深的血细胞计数板,并给出了改良Neubauer血细胞计数板的稀释系数,也可以使用其他深度的血细胞计数板,但计算时需要不同的系数。以下提到血细胞计数板均指改良Neubauer血细胞计数板。

血细胞计数板的结构

血细胞计数板有两个独立的计数池,每个计数池表面有一个3mm×3mm的微小网格,每个计数网格又划分为9个面积为1mm×1mm的大方格。每个大方格的深度为100μm,容积为100nl。但内部格局并不一样,第1、3、7、9号大方格含16个中方格(4×4);第2、8号大方格含20个中方格(4×5);第4、6号大方格含20个中方格(5×4);第5号大方格含25个中方格(5×5),每个中方格又分为16个小方格。由此可知,第1、2、3、7、8、9号大方格均为4排,每排容积是25nl,而第4、5、6号大方格均为5排,每排容积是20nl(下图)。

 改良Neubauer血细胞计数板(左图为9个大方格,右图为5号大方格,圆圈部分为其中一中方格)

改良Neubauer血细胞计数板(左图为9个大方格,右图为5号大方格,圆圈部分为其中一中方格)

使用血细胞计数板网格计数精子

计数精子时以一个中方格为基本计数单位,需要遵循以下原则:

一、仅计数完整的精子(带有头部和尾部),大头针状精子不计数。

二、中方格的边界由3条线的中间线表示,如果精子头大部分位于两条内侧线中间,则计数该精子,如果精子头大部分位于两条外侧线中间,则不计数。

 中方格镜下图像(黑线为边界线,白圈为需计数精子,黑圈为不计数精子)

中方格镜下图像(黑线为边界线,白圈为需计数精子,黑圈为不计数精子)

三、当精子头部大部分位于边界线上时,为避免在相邻的中方格里计数同一精子,应规定只计数其中两条互成直角的边界线上的精子,一般可计数左侧和下侧的分界线。

精子固定液的配制

使用血细胞计数板计数精子时,一般需要加入固定液以稀释精液标本。可按50g NaHCO3和10ml 35%(V/V)甲醛溶液加入1000ml纯水中的比例配制,如果需要,添加0.25g台盼蓝(C.I.颜色指数23859)或5ml饱和(>4mg/ml)龙胆紫(C.I.42555)加深背景显示出精子头部。固定液在4℃冰箱保存,如果溶液中形成结晶,使用前用0.45μm过滤器过滤。

常规精子计数程序

确定稀释倍数

将湿片置于200倍或400倍高倍镜下,计数每高倍镜视野的精子数目,可用来确定精液标本所需的稀释倍数。稀释倍数参考如下表所示:

精液稀释倍数参

由于评估未稀释样本产生的误差较大,可能根据上表推荐的倍数稀释后并不合适(浓度太高无法计数或者浓度太低不能计数到200个精子),这时需要调整稀释倍数,重新取样稀释。另外,为了减少加样误差,取样的体积应不少于50μl,对于黏稠的精液标本,建议使用正向置换式移液器。

加样标准程序

一、通过向血细胞计数板上吹气以湿润计数池的两侧,将盖玻片紧压向计数池的支柱,确保盖玻片紧贴计数池。以两层玻璃间的彩虹(Newton环)证实盖玻片的正确位置(如为磨砂玻璃柱则看不到Newton环,可在每个磨砂玻璃柱上加1.5μl水,有助于固定盖玻片)。

二、按照确定好的精液与稀释液的比例,用正向置换型移液器分别向两个稀释管内转移适量的稀释液,然后再往稀释管内转移适量的混匀精液(注意:混匀后应立即取样,在往管内添加精液之前,擦净移液器吸头外的精液,但是小心不要碰到移液器吸头的开口处,制备第二份稀释样本前应再次混匀)。

三、以最快速度涡旋混匀第一份稀释样本10s,使其彻底混匀,立即取样10μl,以避免精子沉降。

四、将移液器吸头小心接触计数板其中一个计数池的盖玻片边缘,慢慢滴加移液器中的样本,通过毛细管作用使样本充满计数池。在充满的过程中,盖玻片不应移动,计数池不应过满(盖玻片移动)或不满(计数池内有气泡)。

五、按上述步骤将第二份稀释样本取10μl充满计数板另外一个计数池。

六、将血细胞计数板放在湿盒内以防止干片,在室温下静置至少4min,使精子沉降到网格上。

评估精子数目

一、待精子沉降稳定后,在200倍或400倍的相差显微镜下评估,每个计数池至少计数200个精子,以达到可接受的低取样误差。

二、首先评估改良Neubauer血细胞计数板一侧计数池的中央大方格(5号),逐排计数,任何一排都必须数完,不能因为计满了200个精子而停留在某排中间。如果5号大方格计完仍然不足200个精子,则继续计数4号和6号大方格(如4、5和6号大方格计完仍不足200个,不能再计数其他大方格,而是要制备和评估两个新的更低稀释比例倍数的样本),记录所计的排数。

三、在血细胞计数板的另一个计数池中计数相同的排数,即使没有达到200个精子。

四、计算两次计数的精子总数和差异。

五、根据下表确定差异的可接受性(每个值显示两次计数之间的最大差异,此差异为预期在95%样本中仅由取样误差造成的)。

对于一定总数的两个重复计数可接受的差异

对于一定总数的两个重复计数可接受的差异

*基于四舍五入取整数的95%可信区间

六、如果差异在可接受范围内,计算精子浓度。如果差异太大,则制备两个新的稀释样本并重新计数。

在整个评估过程中,始终要做到两次取样、两次稀释及两次计数。计数同一计数池两次,或者使用同一稀释样本填充两个计数池都不是真正的重复检测。有可能在第二次重新计数后,其差异仍超出可接受范围,这时需要进行第三次重新计数。罕见情况下,因为样本的不均一性,致使第3批重复样本也不能提供可接受的差异,在这种情况下,需要取所有重复值的平均值,并将其记录在报告中。

计算精子浓度及每次射精精子总数

精子浓度(C)是精子数目(N)除以相对应的体积,即每个重复样本所计数总排数(n)的体积(第4、5和6号大方格每排均为20nl)乘以稀释倍数。

C=(N/n)×(1/20)×稀释倍数

每次射精精子总数=精子浓度×精液体积

少精子症和无精子症的检测

少精子症的检测

如果每400倍视野中精子数目<4个(即精子浓度<1×106/ml),考虑到精子数目少时取样误差大,对于绝大多数临床检查的目的,报告精子浓度<2×106/ml就已足够,需同时注明是否观察到前向运动的精子。

如果需要准确评估精子数目,也可使用改良Neubauer血细胞计数板进行评估(1∶2的稀释倍数),其操作步骤与常规精子计数程序相同,此处不再赘述。需要注意的是,评估时不再以排为单位,而是以一个大方格为基本单位,即计数到200个精子时,不能停在某排,要将所有大方格全部计完,同时另一个计数池也要计数相同数目的大方格。最后计算精子浓度时,其值为精子总数目(N)除以相对应的体积,即每个重复样本所计数的大方格数(n)的体积(一个大方格的体积为100nl)乘以稀释倍数。即:

C=(N/n)×(1/100)×稀释倍数

由于精子数目少,有可能两个计数池的精子总数小于400个,这时要按计数到的精子数报告取样误差。如果每个计数池观察到的精子少于25个,精子浓度就<56 000精子/ml,当检测改良Neubauer计数池全部9个大方格,并且稀释倍数是1∶2时,这个浓度值是20%取样误差的定量下限。这时报告观察到的精子数目,并注明“计数的精子太少,不能准确测定精子浓度(<56 000/ml)”。

无精子症的检测

无精子症是指射出的精液里没有精子,而不是指睾丸没有生成精子或作为诊断和治疗的依据。当在两张重复湿片中没有观察到精子,疑为无精子症时,应该离心精液标本,以确定是否可在更大标本量中发现精子。可将1ml混匀精液以3000g离心15min,留取50μl精浆重新混匀精子沉淀物后,在两张玻片上各加入10μl沉淀团悬液并覆以22mm×22mm的盖玻片,制成两张湿片后观察。在任一重复样本中观察到精子,则提示隐匿精子症;如果两张重复玻片中均未观察到精子,则提示无精子症。

需要注意的是离心后沉淀物内能否发现精子取决于离心时间和速度以及所检查的沉淀物的量,以3000g离心15min并不能把标本内所有精子离心形成沉淀团,在检查的样本中找不到精子,并不意味在剩余标本里没有精子。

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