1﹒特异性引物的设计

特异性引物和探针的设计取决于方法中应用的试剂。GC含量可以存在变动，但必须在20%～80%范围内。引物长度可以在9～40个碱基，最佳长度为20左右。3 ’端不要有多余的结构以防引物二聚体的形成。引物中的发夹结构也是如此，否则会降低退火的效率。Taqman探针的Tm应在68～70℃之间，以保证探针比PCR反应的引物先退火。显示剂附近的G会淬灭显示剂的荧光，甚至裂解后仍是如此。MGB探针Tm应在65～67℃间，长度不超过20个核苷酸且越短越好。为防止基因组DNA的扩增，推荐将一个引物或探针设计在内含子／外显子 ......