真菌药敏试验
近10年来系统性真菌感染病例明显增多，真菌的获得性耐药株的出现及多种抗真菌药物的可选择性，使抗真菌药物敏感试验成为指导临床医生用药的手段之一。抗真菌药物敏感试验可分为定量试验和定性试验，定量试验可报告最低抑菌浓度（MIC），定性试验可报告试验真菌对药物敏感（susceptible，S）、中介（intermediate，I）和耐药（resistant，R）。 由于真菌药物敏感试验影响因素颇多，如真菌生长的速度、药物在体内的代谢、培养条件等，所以真菌药敏试验结果与疗效的一致性至今是本领域需要探讨的重要课题。本栏目将对与抗真菌药物敏感试验的判断标准；真菌药敏试验的方法学；真菌药敏试验的临床应用等相关的问题进行提问和回答。
纸片法药敏试验的结果
ATB Fungus-3如何观察
临床常用抗真菌药物测
目前哪些抗真菌药物已
| 1 | 答：1992年，NCCLS起草了《酵母菌的液体稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案》，文件名称为M-27P，用于检测引起深部感染的酵母样真菌，包括念珠菌、光滑球似酵母和新生隐球菌等对两性霉...... |
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| 2 | 答：初始方案产生于1998年，命名为M-38P，该方案包括微量稀释法和宏量稀释法，对曲霉菌、镰刀菌、波氏假性阿利什霉等丝状真菌有较好的一致性；2003年NCCLS对某些最低抑菌浓度（MIC）判定...... |
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| 3 | 答：主要有5-FC、FCZ、ICZ、AmB和VCZ，见表：CLSI M-27A2方案规定的MIC参考范围*目前CLSI还未设定AmB对酵母样真菌的MIC参考范围 |
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| 4 | 答：CLSI于2003年颁布M44-P对酵母样真菌纸片扩散药敏试验的判断标准，但只提供氟康唑（FCZ）和伏立康唑（VCZ）的标准，见表：CLSI M44-P对纸片扩散法的判断标准（mm）...... |
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| 5 | 答：CLSI颁布的M-38P是丝状真菌肉汤稀释法抗真菌药敏试验，内容并无丝状真菌敏感性折点，只是描述了测试方案，包括试剂配制、操作方法、质量控制等程序。在临床应用中，按日剂量与MIC...... |
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| 6 | 答：主要根据以下5个因素制定折点：①该药物对各类真菌的MIC的分布；②该药物的血药浓度和组织浓度；③动物试验结果证明制定的折点的有效性；④临床试验结果证明制定的折点的有效性和...... |
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| 7 | 答：新的标准加入PK/PD参数作为抗菌药物临床评价新指标，传统制定折点的方法仅以体外药效学为准，按最低抑菌浓度（MIC）、最低有效浓度（MFC）、抗生素后效应（PAE）等，单一体外药效学数据不能...... |
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| 8 | 答：①Candida krusei（克柔念珠菌）对氟康唑天然耐药，现已颁布的氟康唑对念珠菌的判断标准不适用，不管体外药敏结果均应报告耐药；②AMB对念珠菌目前无判断标准；③伊曲康唑的折点仅适...... |
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| 9 | 敏感性评价中SDD（剂量依赖性敏感）和I（中介）含义有什么不同？答：SDD：其含义是敏感性依赖于用药剂量，如当FCZ的MIC在16～32mg/L时加大用药剂 |
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| 10 | 答：可能是因为只有浓度依赖性药物加大剂量后可以改善药物的疗效，而治疗真菌感染的药物大多是浓度依赖性的，所以在真菌药敏试验时参入SDD的折点更有其重要意义。...... |
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| 11 | 答：宏量肉汤稀释法；微量肉汤稀释法；琼脂稀释法；E-test方法；葡萄糖亚甲蓝琼脂扩散法；自动化系统ATB Fungus-3方法；氧化还原比色法；流式细胞仪测定法。但常用于临床的有：ATB Fungus-3方...... |
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| 12 | 答：宏量肉汤稀释法、微量稀释法和E-test方法可用于丝状真菌药敏的测试。 |
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| 13 | 答：ATB Fungus-3试剂条包括16凹（cupules）形反应杯。第一对不含任何抗真菌剂，用作阳性生长对照。氟胞嘧啶包含一个高浓度一个低浓度2个稀释孔，另外的13对包含不同稀释度的4种抗真...... |
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| 14 | 答：待测真菌均匀涂在葡萄糖亚甲蓝M-H琼脂上，贴浸泡了待测药物的纸片，经24～48小时培养，测定抑菌圈直径，按CLSI颁布的M-44-A的标准判断敏感性。 |
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| 15 | 答：用于酵母样真菌药敏试验的菌株可采用培养1～3天的培养物均可以，不同菌种生长速度不完全相同，根据菌株生长实际状况可作选择。 |
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| 16 | 答：大多数菌株必须在35℃用PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）上活化7天；镰刀菌必须在35℃孵育48～72小时后再在25～28℃孵育到第7天；在孵育7天的菌落上滴加含0.01ml吐温20的生理盐水1ml，制...... |
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| 17 | 答：采集产孢期原始分离培养基上分离的菌落悬浮于含吐温20的生理盐水中，静置3～5分钟，使大颗粒沉于试管的底部，取上层均匀液体（内含试验所需的孢子囊孢子、分生孢子和菌丝体）至另一无...... |
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| 18 | 答：微量稀释法药敏试验采用分光光度计测试菌悬液浓度，不同真菌类别要求浓度不同，曲霉菌、申克孢子丝菌OD值应调节至0.09～0.11（80%～82%透光度），镰刀菌、波氏假性阿利什霉OD值应调至0....... |
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| 19 | ：可通过菌落计算，具体操作如下：将配制好的菌悬液稀释100倍，然后吸取0.01ml，接种于沙保弱葡萄糖琼脂培养基，均匀涂开，35℃培养后作菌落计数。 |
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| 20 | 答：琼脂稀释法真菌药敏试验，要求配制0.5麦氏单位浓度的菌悬液（相当于1 times; 108CFU/ml），再作两倍稀释获得1 times; 104CFU/ml菌悬液，每一药物稀释孔加入5mu;l菌悬液。...... |
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| 21 | 答：琼脂扩散法和E-test真菌药敏试验要求接种物配制0.5麦氏单位菌悬液，相当于1 × 108CFU/ml。 |
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| 22 | 答：抗真菌药物含量是否计算正确是真菌药物敏感试验能否正确报告的重要因素，所以必须正确配制试验药物的溶液：因为临床制剂常常为了溶解和使用的需要加入其他药物成分如复性剂等...... |
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| 23 | 答：①按厂家提供的分析含量称重，如厂家说明书提示该药物的分析含量为99.5%，即1mg = 0.995mg；②按计算公式计算你需要的浓度下的溶液应称该药物的质量：质量（mg）=体积（ml需要配制溶液...... |
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| 24 | 答：配制储存液首先要确立配制的浓度。选择试验需要配制的浓度系列，浓度系列中最高的含量为基准；配制高于最高含量10倍的超浓溶液，即可成为试验药物的储存液。对难溶于水和不溶于...... |
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| 25 | 答：不溶于水或难溶于水的药物可用二甲亚砜（DMSO）、乙醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素等非水溶剂进行溶解，但具体应选择哪一种应根据厂家提供的资料作决定。对用非水溶剂溶解的药物应...... |
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| 26 | 答：常用的抗真菌药包括氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和新三唑类抗真菌药如伏立康唑。测试的MIC范围见表：常用抗真菌药MIC测试稀释范围...... |
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| 27 | 答：稀释系列应包含CLSI提供的判断折点的敏感、中介和耐药的浓度范围；无判断折点的药物可根据该药物药代动力学数据获得的体内疗效评判标准如Cmax/MIC制订稀释范围；按药敏试验报...... |
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| 28 | 答：培养温度要求在35℃，但培养时间按不同真菌类别是不相同的，如根霉菌需培养21～26小时可判读结果；而镰刀菌、曲霉菌和申克孢子丝菌需培养46～50小时才判读结果；波氏假性阿利什霉需孵...... |
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| 29 | 答：氟康唑和伏立康唑（可用美国BD公司BBL产品），另外有ROSCO公司生产的多种抗真菌药物的纸片，包括有氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、两性霉素B和氟胞嘧啶等。如采用ROSCO纸片应按说明书...... |
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| 30 | 答：酵母样真菌纸片扩散法要求35℃培养24～48小时后观察结果。 |
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| 31 | 答：抗真菌药E-test方法可适合多种真菌的药敏测试，包括酵母样真菌，如念珠菌、隐球菌；丝状真菌，如曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨头霉、外瓶霉、帚霉等的药敏测试。...... |
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| 32 | 目前有哪些抗真菌药E-试验条可供临床微生物学实验室进行E-试验药敏测试？答：有氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶、伏立康唑和两性霉素B的E-试验条可以提供临床微生物学实验...... |
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| 33 | 答：孵育温度和时间应根据不同的真菌有所不同，对念珠菌可置35℃ 24小时培养后观察结果；对隐球菌需要在35℃培养48小时观察结果；部分真菌需要27℃培养；慢生长的真菌需要培养72小时；...... |
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| 34 | 答：不能，ATB Fungus-3只能用于测试酵母样真菌对抗真菌药的敏感性。 |
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| 35 | 答：需把试剂条放入一个密封容器或是一个装有吸潮纸的GENbox型广口容器里，在有氧条件下35℃（+ 2℃）的环境中，念珠菌属要培养24小时（+ 2小时），新型隐球菌要培养48小时（+ 6小时）后观察结...... |
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| 36 | 答：Fungus-3试剂条中氟胞嘧啶只有2个稀释浓度，一个高浓度，另一个低浓度，报告以敏感度报告；对AMB、FCA、ITR、VRC可报告MIC值。要正确阅读ATB Fungus-3药敏结果应遵守以下规则：一、...... |
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| 37 | 答：对于氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC），用ATB Fungus-3所获得的I分类相当于CLSI定义的SDD（susceptible dose-dependent，剂量依赖型敏感）。 |
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| 38 | 答：在检测白念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌时，氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑可出现拖尾现象，导致MIC偏高，尤其在使用仪器判断结果的时候。针对这三个药建议用肉眼判读其MIC值，特...... |
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| 39 | 光滑念珠菌对氟康唑和伊曲康唑存在固有的敏感性低的现象，应如何报告结果？答：针对光滑念珠菌的检测，建议将其对氟康唑和（或）伊曲康唑敏感的结果改为中介，因为该菌对这两个药存在固有...... |
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| 40 | 答：由于真菌药敏的结果判断需要考虑多种因素，不同的药物有不同的终点定义，所以真菌药敏的质量控制应随每一批药敏试验同时进行是最理想的；在更换试剂的批号或在自动化系统软件升...... |
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| 41 | 答：有近平滑念珠菌ATCC 22019；克柔念珠菌ATCC 6258。 |
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| 42 | 有黄曲霉ATCC 204304；烟曲霉ATCC 204305。 |
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| 43 | 答：标准菌株和参考菌株都是实验室用于质量控制的参照物，也常用于设备、试剂校正的参考物。但标准菌株和参考菌株是有不同的，标准菌株是指某些菌株具有某种标准菌株的典型的生物...... |
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| 44 | 答：黏膜感染念珠菌，建议经验治疗，不需要做药敏试验。 |
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| 45 | 答：复发性黏膜念珠菌病初始治疗时只需做菌种鉴定，如果治疗失败再考虑做药敏试验。 |
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| 46 | 答：从痰标本分离出念珠菌常常是口腔污染，或是定植菌，念珠菌引起下呼吸道感染的机会是极少的，所以在无确切证据证明所分离的念珠菌是致病菌不必做药敏试验，也不需要用药。如能确定...... |
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| 47 | 答：念珠菌血症初始治疗应参考当地药敏试验流行病学资料，并同时做唑类抗真菌药物的药敏试验，根据药敏结果继续或修正治疗方案。 |
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| 48 | 一个肝移植患者，多次血培养分离到念珠菌，但氟康唑治疗无效，需要做药敏试验吗？答：该病例为肝移植患者，而且已发生真菌血症，氟康唑治疗失败，有几种可能，其一可能是非白念珠菌感染；其二可...... |
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| 49 | 答：当前伊曲康唑药敏判断标准是基于黏膜念珠菌感染制定的，伊曲康唑的血药浓度和组织浓度差异大，各组织间药物能达到的浓度也各不相同，在同样的治疗条件下，脂肪中的药物浓度高于血...... |
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| 50 | 答：两性霉素B的抗真菌谱可覆盖酵母样真菌、曲霉菌和毛霉菌，虽然CLSI没有明确规定判断标准，但认为当MIC 2mg/L时应报告耐药。对念珠菌属通常认为MIC = 0.25即代表是耐药菌株...... |
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| 51 | 答：氟胞嘧啶治疗念珠菌属主张联合用药，单独用药很快产生耐药性，所以CLSI推荐的判断标准也是针对联合治疗的，如氟胞嘧啶药敏结果为敏感（S）时提示的是其与其他药物联合用药所能获得...... |
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| 52 | 答：新型抗真菌药物伏立康唑参照M27-A的方法作酵母样菌的药敏试验，与临床有较好的相关性，结果可靠，重复性好。但卡泊芬净用M27-A方案测定酵母样菌药敏试验和用M38-A方法做产孢丝...... |
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| 53 | 答：如真菌药敏试验提示敏感的念珠菌属真菌的药物90%治疗有效，但药敏试验提示耐药者仍有60%对治疗反应良好。 |
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| 54 | 答：①真菌药敏试验与疗效的相关性存在难以明确的原因，如体外试验结果存在局限性，耐药株少见，缺少理想的动物模型，缺少记录完整的病例；②抗真菌药物的疗效受多种因素的影响：如不同组...... |
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| 55 | 为什么测定抗真菌药对受试真菌的最低抑菌浓度（MIC）对临床医生的帮助更大？答：文献报道剂量（DOSE）/MIC比值与疗效的关系对临床更有指导价值。当DOS/MIC比值超过25以上时，治疗成功率在...... |
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| 56 | 答：重复性差常发生在三唑类抗真菌药物，其原因是判断终点会产生拖尾现象，终点的判断可以是被测试真菌完全被抑制，也可以80%被抑制，由此可产生重复性差的现象。...... |
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| 57 | 答：①规范操作现有的药敏试验，做好质量控制；②建立对卡泊芬净等新药的体内和体外相关性好的药敏试验方法；③建立不产孢丝状真菌的体外药敏试验的方法；④提高现有真菌药敏试验的可...... |
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