二、体外基因突变的策略和步骤

传统的定点突变研究需要用到单链DNA模板，如克隆在M13丝状噬菌体（M13 phage）上。近年来，由于PCR技术的成熟，可以采用PCR技术直接从双链模板上进行定点突变。这里先介绍利用单链噬菌体M13进行定点突变的方法，再介绍利用PCR进行单一位点或多位点定位突变的过程。锚定引物及定点突变引物用T4多核苷酸激酶磷酸化后，与模板质粒DNA进行退火，再使用T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行延伸和连接形成突变单链，然后使用锚定引物“尾巴”上的特异性引物（ETail-F / ETail-R）和高保真DNA ......