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21世纪干细胞概念的更新

成体干细胞

成体干细胞是21世纪初生物学的伟大发现,它改变了干细胞传统的理念。20世纪末,一些科学家们报道,在许多成体组织中,有一些细胞可以在体外被某些细胞因子诱导分化,变为和原组织不同的组织细胞。如肌肉匀浆中诱导发生造血细胞,脂肪组织中诱导发生神经原细胞等。可惜由于作者们当时尚对成体干细胞毫无认识,错误地认为是组织细胞“横向分化”的结果,对这些重大的发现却下了错误的结论。然而,这些作者的划时代的贡献不能抹杀,他们在事实上发现:在成体组织中仍然残存胚胎发育过程中的,包括各胚层定向的、组织定向的各类干细胞。原来在胚胎发育的每个阶段都有少部分干细胞,中止参与胚胎发育,它们都转入G0静止期,既不增殖又不分化,却仍然保持原来的干细胞基本特性。当胚胎不断发育成长,而那些不参与胚胎发育的处于静止状态的各类成体干细胞,却依然遗留在机体的各种组织中。出生后随年龄的增长,各种成体组织中仍保留各种类成体干细胞基本特征不变。在体外适当的细胞因子诱导刺激下,它们可以从G0静止期转入细胞周期而增殖,而且分化成为某种组织定向细胞。然而,组织定向干细胞的分化,只能沿循着本组织的分化途径进行分化,进行有限的“多向分化”而已。例如造血干细胞的多向分化,仅限于髓系和淋巴系的造血细胞各支系的纵向分化。组织干细胞分化是有限的可塑性,它和胚层干细胞在本胚层内多向分化的可塑性不同,和原始的桑葚期胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)可向各个胚层分化的可塑性更是完全不同。总之,组织干细胞的分化只限于本组织的分化支系,其分化不可跨越本组织定向的限制,更不可能突破胚层源的界限。唯独ESC具有全方位的向各个胚层分化的全能的可塑性。

骨髓中蕴藏着许多类别的成体干细胞。20世纪之前,人们只知道成体组织中(如骨髓)含有造血干细胞。造血干细胞是最早被发现的成体干细胞。在成体组织中除了造血干细胞外,还有没有其他组织的干细胞呢?但由于缺乏体外诱导分化的技术和细胞因子,过去不可能发现骨髓或其他成体组织中还含有各类的成体干细胞。所以长期以来,干细胞生物学的研究只限于造血干细胞。20世纪的文献中提到骨髓干细胞就不言而喻地指造血干细胞,似乎骨髓中只含有造血细胞和支持造血的基质细胞,但现在看来,这显然是错误的。骨髓中成体干细胞不仅包括造血干细胞、间充质干细胞,而且还有其他各个胚层来源的干细胞及其分化的后代,即各类非造血组织的干细胞,如神经干细胞、肝脏干细胞等。它们统称为“成体干细胞”(adult stem cells,ASC)。美国明尼苏达大学Verfaillie C等做了大量的实验研究,有力地证明了成体干细胞的存在,否定了“横向分化”的假设。他们给成体干细胞另命名为“多向分化潜能成体祖细胞”(multipotential adult progenitor cell,MAPC)。由于这命名用词不完善,国际上多数学者仍用“成体干细胞”的命名。

至今尚没有任何可能进行一种实验,用绝对纯化的正常的组织干细胞克隆来证明组织定向干细胞可以向非自身组织的方向进行分化。在生物界或人类医学史上也从未出现过因“横向分化”所致的疾病。所以,“横向分化”只不过是缺乏证据的假想。

正常的天然的组织或器官,都不是单一品种的细胞所构成,而都包含了多种组织细胞和多种成体干细胞。肌肉匀浆中不仅仅是肌肉细胞,脂肪组织中也不仅仅是脂肪细胞,其中还有各种成体干细胞。缺乏这个新概念的学者们,在自己的实验结果中,没有考虑到体内成体干细胞的普遍存在,更没有抓住成体干细胞的重大发现,却得出“横向分化”的推论。近年来,越来越多的科学家们凭借周密设计的科学实验中发现的事实,和成体组织中存在成体干细胞的证据,质疑“横向分化”等。Donald Orlic (2001)在Nature发表论文,指出造血干细胞在输注后可以到心肌缺血损伤部位横向分化为心肌细胞,修复损伤。于是许多实验室和病房蜂拥而上。2004 年4月,Nature刊登了由两个不同的实验室的两篇论著,作者Murry CE等和Balsam LB等各自用充分的事实证明,输注的CD34+造血干细胞到达损伤的心肌部位却仍然分化为CD45+造血细胞,而没有变为心肌细胞的任何证据。Nature杂志编辑部在同一期写了专评,以客观的科学态度进行评论。科学就是在不断纠正错误认识的过程中发展的。

间充质干细胞

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是中胚层分化而成的一种非造血成体干细胞,它在体外贴壁生长,在适当条件下,可以大量扩增,分化为间充质细胞(mesenchymal cell,MC),即间充质祖细胞,并继续分化为脂肪、骨、软骨、血管内皮、成纤维细胞等各种结缔组织细胞。越来越多的研究证明从许多成体组织(如骨髓、脂肪、肌肉、心、肝、脐带血、羊水及胎盘等)可分离得到MSC。

国际上许多实验室各自建立分离MSC的方法,但这些方法之间没有进行认真比较,也没有标准化。MSC的分离方法包括花几周时间的传代多次的细胞培养。这就引起疑问:体外传代多次而扩增的MSC是否和体内天生的MSC完全相同呢?体外MSC实验结果是否能表明体内MSC潜在的生物特性?尽管众多的表面标志用来检测MSC,但至今还没有一个公认的可用来鉴定人的真正MSC的专一特异性表面标志。所以,鉴定MSC培养扩增的后代时,不得不检测一系列表型,即CD34、CD45及HLADR阴性,CD105(SH2)、CD29(SH3)、CD73(SH4)及HLA-Ⅰ类抗原等阳性。试问,一个原始未分化的干细胞表面怎么会表达那么多的分化抗原呢?事实上经过多次传代长期体外培养扩增的,绝大部分细胞都已经是MSC的分化后代,即表达各种分化抗原的各类已经定向分化的间充质细胞和终末分化而成的各种结缔组织细胞。其实,间充质干细胞在培养扩增后仅仅占极少数。遗憾的是,经多次传代又长期扩增分化后,所收获的绝大多数已经分化了的后代细胞居然还能被误认为“干细胞”、“MSC”。由于结缔组织细胞的周转率极慢,建立一个可以检测MSC体内能否分化为各类间质细胞或结缔组织动物模型,是很困难的。就如用动物模型观察能否在体内长期全面重建髓-淋巴系造血,便可无可争议地鉴定造血干细胞。但对间充质干细胞的鉴定除需要用一系列表型外,还要用体外诱导分化为骨软骨脂肪等后代细胞的方法,来鉴定间充质干细胞。至今还没有一个可以专一地鉴定间充质干细胞的实验指标。所以鉴定MSC的检测,必须既查一系列表型,又要查诱导分化MSC的后代细胞,才能确定样品中是否含有间充质干细胞。

许多间充质干细胞可塑性的研究都采用了上述长期培养扩增方法,所获得的含有MSC/MC的混杂的异质性细胞群进行实验,然后说源自间充质干细胞可以在体外诱导分化,变成外胚层源的神经原细胞或内胚层源的肝干细胞等,即所谓“横向分化”或“去分化”等的结论。这些推论是建立在很不周密的实验基础上。由于至今还没有方法可以在体外纯化或克隆化间充质干细胞,当前唯一的方法是体外富集MSC,即收集培养贴壁的细胞,即经过多次传代和长期扩增的方法。在收获的间充质细胞群中,不可避免地混杂了同样也贴壁生长的,包括神经干细胞,或肝干细胞等各种成体干细胞。各种“横向分化”推论的实验都无法排除一个可能,即在体外诱导分化所得的某种组织细胞,是从培养体系中某些其他类别的成体干细胞经过正常的纵向分化而来。“横向分化”的实验都存在一个根本性的缺憾,即当前缺乏一种可以有效地分离、鉴别或克隆化各种各样的正常胚层干细胞和正常非造血组织干细胞的技术,因为各种正常非造血干细胞在形态学、表型、密度和贴壁生长等特征是相同的,无法分离纯化。而且,它们高度的多向分化潜能,即在细胞增殖的同时都要进行分化的潜能,使正常的组织干细胞克隆化成为不可能。只有分化受阻的恶变细胞才能克隆化而成为纯一的细胞系,细胞无限增殖而不分化。在没有纯化的组织干细胞系(如神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮干细胞、肝干细胞等)的实验条件下,使用混杂许多类别成体干细胞的不纯干细胞样品进行实验,就无法证实这些不同组织定向的干细胞是否会互相转化,做推论都缺乏科学根据。

造血干细胞移植物中应有间充质细胞

最理想的造血干细胞移植物中应该含有间充质细胞。尽管上述对间充质干/祖细胞(MSC/MC)横向分化的质疑还在继续中,培养扩增的间充质干/祖细胞(MSC/MC)作为细胞治疗的动物实验和临床应用都取得显著的效果。目前,很值得用培养扩增的MSC/MC进行造血干细胞移植临床试验,即从同一位异基因非亲缘性HLA不全相合供者的骨髓来源的MSC/MC,和其骨髓或外周血干细胞共输注;或用亲缘单倍体相合异基因供者骨髓来源的MSC/MC和非亲缘HLA不相合脐带血干细胞共输注移植;或用实体瘤患者或慢性髓系白血病患者的自体骨髓和其自体MSC/MC共输注移植;或在输注前移植物细胞与自体MSC/MC在体外共培养等,都是文献中已有报道,也是许多血液学家们所感兴趣的。

在MSC/MC基础研究方面有不少问题值得探索。MSC/MC和移植物细胞或CD34+细胞共输注移植,MSC/MC起了什么主要的作用?MSC/MC促进移植和减轻移植并发症GVHD等的主要机制是什么?MSC/MC是否和移植物细胞一样地也在宿主骨髓中植入?MSC/MC是否能重建已被预处理破坏的宿主骨髓的造血微环境?已经有不少报道,MSC/ MC提高了造血干/祖细胞黏附分子SDF-1的受体CXCR4的表达从而促进了植入。许多实验已经证明MSC也可以和造血干细胞一起长期植入,重建骨髓造血微环境。MSC/MC有免疫负调控作用,抑制T细胞的异基因增殖反应,在淋巴细胞混合培养中抑制增殖反应。这些都有助于理解MSC/HSC共输注可以减轻GVHD。但又不清楚为什么并不因此而减弱了移植物抗白血病作用(GVL)。在骨髓移植物已经包含了间充质干祖细胞,动员的外周血单个核细胞中也含有间充质细胞,胎盘组织中也有很多MSC/MC,唯独脐带血中含MSC/MC较少。这也可能是单纯脐带血移植的植入率不高的原因。

成体干细胞的生物学特点和新的细胞治疗

临床和动物实验都已经证实成体干细胞有两个引人注意的生物学特征:①成体干细胞注入体内后,有明显的趋化性,较明显地集中到达受损伤的部位。②成体干细胞到达受损伤的部位后,在局部微环境的诱导下,发生明显的诱导分化,使成体干细胞向损伤组织修复所急需的组织细胞分化,从而促进损伤组织的修复。这个现象,被称为“局部专一诱导性分化”(site-specific differentiation)。从此,为成体干细胞开辟了新的细胞治疗临床应用适应证。促进了干细胞工程和组织工程的发展。如用骨髓的成体干细胞对心肌梗死、难治性骨关节坏死或肢体缺血坏死等进行了治疗,国内外都有成功的报道。然而,在没有得到体外和体内充分证据时,不宜轻易下结论是骨髓造血干细胞移植治疗了缺血性心肌坏死或下肢坏死等。可笼统地说是骨髓源干细胞治疗,或骨髓源的成体干细胞的治疗,虽然含糊,却是确切无误的。

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