何进行血培养瓶的性能评价?

答:血培养瓶系统评价非常复杂,根据检测原理不同,可分为感应元件评价与培养基的评价。根据符合率又分为灵敏度和准确性评价:灵敏度评价分为感应元件灵敏度,苛养菌、双相真菌生长支持与临床标本平均报阳时间评价;准确度评价主要是临床样本的假阳性和污染率评价。对于含抗生素灭活体系(如树脂和活性炭等)的还应该进行抗生素灭活或吸附能力评价。按照评价经过与环节,分为基本促生长能力评价、模拟菌血促生长评价,以及大样本临床试验。

感应元件评价

双相瓶的固相为双相瓶的感应元件,而自动化血培养仪配套血培养瓶主要是其底部的感应膜。前者可观察流感杆菌、肺炎链球菌等苛养菌在固相上是否生长作为双相瓶感应元件合格与否的评价标准;而后者根据不同厂家检测原理制订相应的检测流程。例如梅里埃Bact/Alert 3D血培养系统,采用化学方法制备CO2检测感应膜对CO2的感应灵敏度,试剂可用一系列不同浓度的NaHCO3溶液与对应浓度的一系列稀HCl溶液,按一定量(按照NaHCO3与HCl摩尔数1∶1反应的量)分别先后注入瓶内再放入仪器检测,记录报阳时间,测出感应膜能检测到的最低CO2产生量。BACTEC 9000系列或FX系列,都属于双通道检测原理,即同时检测CO2产生和O2消耗(需氧瓶),需要在评价CO2感应灵敏度的同时检测O2消耗感应灵敏度。具体做法可采用抽气换气法,即用注射器抽真空的办法抽出一系列不同体积的瓶内氧气,再注入相同体积的N2的方法制备不同氧化还原电势的瓶子,再将瓶子放入仪器中检测,记录报阳时间,测出瓶子能感应出的最低O2消耗量(即能被仪器测出的抽出气体最少的那瓶,所抽出的氧气量)。

培养基评价

按照试验次序依次为基本促生长能力评价:即使用肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、马尔尼菲青霉菌(经BHA 35℃培养形成酵母相)分别制备并稀释成一列不同浓度菌悬液。然后将菌液注入瓶内,同时做平板法菌落计数,进行实际活菌浓度校正,将形成每瓶内< 1CFU、1~10CFU、10~100CFU、100~1000CFU、1000~10 000CFU五个系列的血培养瓶放入仪器中检测,一方面测定并记录仪器对不同种类细菌、不同接种量情况下的报阳时间,另一方面通过按规定时间段吸出瓶内液体传代固体培养基做菌落计数(接种量较高的需稀释后接种),绘制每种细菌在不同接种量情况下的生长曲线(t-logN,时间-细菌浓度对数曲线)。通过对不同品牌血培养系统检测同一种细菌相同接种量情况下的生长曲线的比较,我们可以了解到曲线斜度越陡峭的生长速度越快,并且报阳时间更短的血培养系统更优秀。通过仪器对上述瓶子的检测可测试出培养基针对上述不同苛养性细菌、真菌的最低检测限度——即在仪器上经过5天培养仍不报阳性的接种量。

模拟菌血促生长评价

试验方法与“基本促生长能力”评价相同,只是增加在每个血培养瓶内均注入5ml健康人血液的环节。血液可采用血站健康自愿者捐献的24小时内采集的新鲜血液。注意,为了平行测试不同品牌血培养系统针对相同细菌的检测能力,试验条件应尽可能相同,针对同一种细菌时,不同品牌血培养瓶内所注入的血液应为同一个献血者的血液。由于通常一个自愿者捐献的血液为200ml,最多可测试40个瓶子,由于每种菌稀释成的五个梯度为一个系列,则可使用一个系列同时评价8个不同品牌(如果要求重复试验的话,则每次可评价的厂家数相应减少)。不同系列可采用不同献血者的血液。如果一次只评价2个品牌时,不重复试验的情况下,只需300ml血液即可完成试验。因而做好实验设计是得出准确评价结果的前提。

临床试验

根据诊断试验的样本含量估计公式:

n1 =Ua2p1(1 − p1)/d2

n2 =Ua2p2(1 − p2)/d2

其中,敏感度(p1)即为文献报道的普遍阳性率,约为10%;特异度(p2)即为除开污染率的以外的真阴性与真阳性之和,由于文献报道的污染率大多在4%左右,因而特异性即为96%;允许误差(d),设α = 0.05(双侧),则d = 0.08;计算得到具有统计学意义的临床试验最低样本量为:阳性需要检出至少54例,污染标本至少要遇到24例,则所需要的最少标本总量为540 + 600 = 1140(瓶)。

试验方法为采用盲法,遮住瓶上商标,标注为A、B两个厂家。将A、B两种不同品牌血培养瓶发放到临床,同一个患者采用双部位采血;采血时同时从同一部位采集2倍量的血液,一半注入A瓶,另一半注入B瓶。同时放入血培养仪中培养,采用相同的方法处理阳性与阴性培养瓶。最后统计各自的阳性率,平均报阳时间,苛养菌与双相真菌检出率,假阳性率(定义为血培养仪报阳,但涂片以及传代培养均阴性)与污染率(定义为单瓶阳性,分离菌药敏试验结果与临床治疗反应不一致,与PCT、CRP等感染标志物检测结果提示的情况不一致)。通常认为,阳性率越高,平均报阳时间越短,苛养菌与双相真菌检出率越高的血培养系统更优秀,而假阳性率与污染率则越低越好。

抗生素灭活与吸附试验

根据不同厂家不同类型的瓶子,制订相应的试验流程。为体现抗生素灭活与吸附体系效能,在试验用菌株的选择方面应尽可能选择对抗生素敏感性较高的野生菌进行试验。在细菌的接种量上应尽可能模拟临床,接种量儿童瓶不得超过每瓶1000CFU,成人瓶不得超过10CFU。抗生素浓度选择应为临床治疗浓度的最高剂量。抗生素种类应贴近临床,选择临床最常用的抗生素种类,按照CLSI规则推荐用于各类细菌测试的抗生素列表进行选择,要求每个家族的抗生素至少选择一种进行测试。通常观察时间设置为5天,如选用布鲁菌作为试验菌株则可将观察时间延长为2周。

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