飞秒激光与眼角膜组织的相互作用

前已述及,飞秒激光(femtosecond laser)是一种以脉冲形式运转的近红外线激光,是一种超短脉冲激光。应用物理学原理:功率=能量/时间,可知在较小的激光能量下就可以产生极高的瞬间功率。通常情况下,皮秒脉冲激光的功率密度可达到等离子体阈值的几倍,这时,只发生光蚀除作用而没有机械的副作用。而当脉冲的持续时间加长时,要达到光致破裂作用的能量密度,就会引起较大的机械副作用。在角膜屈光手术中,我们希望能够有一种激光可以达到极高的能量密度,使角膜组织发生光致破裂作用,将角膜组织分开,而不引起较大的机械副作用。飞秒激光拥有较高的能量密度,很容易产生多光子吸收而产生大量的“幸运电子”,从而发生电子的雪崩效应,最终产生光致破裂作用。所以将激光脉冲限制在飞秒量级可以达到我们在手术中的要求。以下我们将对角膜组织在超短脉冲激光聚焦下产生的光致破裂作用进行详细的讨论。

要在组织内部产生光致破裂作用,所吸收的能量要比发生等离子体蚀除作用所需要的能量高出两个或更多的数量级,而且在此过程中自由电子的密度和等离子的温度也会高出许多。

由于自由电子和等离子体温度突然升高,通常能达到10 000K的几倍以上,这个温度可表现为自由电子的动能。等离子体的电子不会被限制在激光束的焦点区域,而是扩散到周围介质中去。当有惯性的离子在一定时延后跟着运动时,质量就移动了,这就是冲击波产生的基本根源。冲击波很快离开等离子体的边缘,他们开始以超声速移动,然后降低到声速。

Vogel等人(1994年)对皮秒激光和纳秒激光脉冲产生的冲击波进行了计算,对于脉宽为30皮秒,能量为50μJ的激光脉冲,在它产生的激光等离子区的边缘的初始压力为17kbar (1bar=0. 1MPa)。而对于脉宽为6纳秒,能量为1mJ的脉冲,它的压力为21kbar。两者的压力值相似,但是皮秒脉冲的压力衰减更为迅速。在冲击波的发射中心大约50μm的距离处,压力已降为1kbar,而对于纳秒脉冲来说,要降为1kbar大约要有200μm的距离,见下图2。

等离子体的形成:当一连串的飞秒激光有序地聚焦于角膜组织的一定深度时,每个脉冲点都产生一个蒸发角膜组织(蚀除角膜组织)的微等离子体气泡

图1  等离子体的形成:当一连串的飞秒激光有序地聚焦于角膜组织的一定深度时,每个脉冲点都产生一个蒸发角膜组织(蚀除角膜组织)的微等离子体气泡

当等离子体(上图)在角膜组织内部发生时,超短脉冲激光产生的空化作用就会发生,自由电子和等离子体的高温使聚焦区附近的组织发生汽化作用,产生高温高压的气泡,这种气泡对其周围组织做功,这时,动能就会转变为储存在膨胀气泡中的势能,气泡中的水和二氧化碳发生剧烈膨胀。由于气泡周围的正常组织的静止压力又使得气泡不能无限制的扩张,将水和二氧化碳压缩,气泡内部的温度和压力又再一次升高,从而再次膨胀。在很短的时间内这个过程会重复好多次,直到能量被消耗殆尽。在气泡重复膨胀和塌陷的过程中,冲击波仍以声波的形式向周围传播,直到气泡塌陷、水和二氧化碳被周围组织吸收为止。图3为微等离子体以超音速的速度迅速膨胀,产生冲击波向周围传播,并形成一个空化气泡。图4为气泡塌陷时冲击波仍以声波的形式向周围传播。空化气泡的气泡不仅包括氢(hydrogen)和氧,在角膜组织还有氮(nitrogen)、一氧化碳(CO)和甲烷(CH4)等存在。

在水中,光致击穿后计算得到的冲击波压力。击穿分别是用Nd:YAG激光脉冲

图2 在水中,光致击穿后计算得到的冲击波压力。击穿分别是用Nd:YAG激光脉冲(脉冲持续时间30ps,脉冲能量50μJ)和Nd:YAG激光脉冲(脉冲持续时间6ns,脉冲能量1mJ)产生的。横坐标是离发射中心的距离(Vogel等,1994年)

在角膜组织中,当超短脉冲激光聚焦于角膜内部时,以上等离子体的形成、冲击波产生和空化作用将会发生,最终产生的高压气泡将角膜组织撑开。当无数连续的聚焦点相继发生空化作用时,相邻气泡相互融合,将会在角膜组织内部产生切割现象。相邻的气泡融合将在角膜组织内形成一个分离面,将角膜分开。图5为光学相干断层扫描(OCT)下观察到的飞秒激光在角膜基质内进行切割后形成的气泡融合平面。由于冲击波的传播距离非常短,在组织中的损害只局限于亚细胞层,而空化气泡的大小通常可达到几十到几百微米,所以通常宏观上观察到的光致破裂作用和机械性作用主要是来自于空化作用。

最初尝试应用于角膜屈光手术中的超短脉冲激光是皮秒激光,但是这种激光由于机械副作用太强,特别是在角膜组织内形成的空化气泡太大,所以没能在角膜屈光手术中得到应用。激光引起的气泡的大小和冲击波的扩张范围主要取决于激光脉冲的能量。为了达到发生光致破裂作用的能量密度阈值,我们可以通过缩短激光脉冲的脉宽,从而在一定程度上降低脉冲能量。现在的激光系统可以产生飞秒量级的激光脉冲,飞秒激光只要1μJ的能量就可以达到能量密度阈值,当应用的物镜的数值孔径较大时,飞秒激光的能量可以降低到nJ范围内。这样,机械性副作用就会大大地降低。所以,飞秒激光的光致破裂作用就使在角膜组织内进行透镜的切割成为可能,成为角膜屈光手术发展的一次飞跃。

在1997年,美国工程学院和医学院的研究者首次把飞秒激光应用于角膜手术,并成立了IntraLaser公司以研发应用于临床的飞秒激光器,并在2000年获得美国FDA正式批准,这种激光器波长在1053nm,脉宽约为500飞秒,脉冲重复率为1~10kHz,除此之外此后还有多家公司(德国的Femtec、瑞士的Femto LDV以及德国蔡司的VisuMax等),每种飞秒激光器的参数不同,对角膜组织的切割效果也有所不同。通常影响角膜组织切割效果的主要激光参数是脉冲能量和脉冲之间的点间距。在脉冲点间距一定的情况下,当脉冲能量较高时,聚焦点区域产生大量等离子体和自由电子,空化作用进一步加强,产生较大的气泡。由于角膜组织自身的紧密性,当气泡较小时,气泡与气泡相互融合,可以被束缚在一定区域。而当储存在气泡内部的水和二氧化碳的势能较大时,角膜基质中的胶原纤维之间的链接将无法束缚气泡的膨胀,气泡会在链接比较疏松的胶原纤维板层之间迅速扩散,形成致密的不透明的气泡层(opaque bubble layer,OBL)。

图3 冲击波的形成:微等离子体以超音速的速度迅速膨胀,产生冲击波向周围传播,并形成一个空化气泡

图4 气泡塌陷时冲击波仍以声波的形式向周围传播,

相邻的气泡相互融合,在角膜组织内形成一个分离面

图5 飞秒激光在角膜基质内进行切割后形成的气泡融合平面(OCT图像)

图5 飞秒激光在角膜基质内进行切割后形成的气泡融合平面(OCT图像)

当能量较小时,由于点间距一定,产生的较小的气泡不足以相互融合,所以一些区域会在切割面残留大量的组织链接,我们通常将这些未被分离的组织链接称为组织桥,在分离两层角膜组织时,组织桥将会成为主要的阻力,由于需要机械力将其分离,所以在一定程度上增加了对角膜组织的损伤。同时,组织桥的存在也使得分离后的角膜组织表面变得粗糙、不规则。在角膜这个透明的屈光介质中出现大量不规则的组织链接,将会影响光线的透射和折射,最终影响到视觉质量。图6A为低能量的飞秒激光在新鲜的猪眼角膜上扫描后,由于组织桥的存在使得角膜基质床表面变的粗糙和不规则。

图6 不同能量的飞秒激光切割猪眼角膜后的表面质量(脉冲持续时间220~580fs,频率为500kHz),(A)脉冲能量:130mJ,(B)脉冲能量:160mJ

所以,我们在用飞秒激光进行屈光手术过程中,尽量寻找一个能量和点间距最为合适的参数,既可以使产生的气泡能够完全相互融合,又不至于产生OBL。既要对角膜组织的损伤最小,又可以产生一个光滑的切割表面,减少对术后视觉质量的影响。图6B为一个能量和点间距比较合适的参数扫描的基质床表面,其光滑的表面将会减少光线通过时发生不规则的散射等影响。

飞秒激光在电脑的控制下,可以在角膜组织内进行精确的切割。传统的LASIK手术采用机械性角膜板层刀制作角膜瓣,但是用机械刀制作的角膜瓣的均匀性较差,通常是中央薄周边厚,为一新月形,并且瓣的边缘为一过度的锐角,从瓣下的基质床我们可以看到,边缘为钝角形。这种形状的切口加大了角膜的损伤面,在一定程度上增加了伤口的愈合反应。图7A是用机械性角膜板层刀在猪眼角膜上制作角膜瓣后切口的边缘和残留的基质床表面,可以看到在进刀的地方的形状具有一定的坡度,并且在进刀时,边缘的上皮在刀头的推力下受到破坏,一些上皮随着刀片进入基质床,成为术后引起上皮植入的危险因素。而图7B为用飞秒激光制作角膜瓣时的侧切口,其侧切角度在术前设定为90°,术后的SME观察可以看到与术前的预设角度基本一致。这种直角形的切口减少了对角膜组织的切割面积,同时减少了对角膜神经的破坏,并且复位角膜瓣后可以很好地对合,避免了上皮的植入,有利于术后的伤口愈合。

(A)用机械性角膜板层刀在猪眼角膜上制作角膜瓣后切口的边缘和基质床的表面;(B)用飞秒激光制作角膜瓣时的90°侧切边缘及基质床表面

图7:(A)用机械性角膜板层刀在猪眼角膜上制作角膜瓣后切口的边缘和基质床的表面;(B)用飞秒激光制作角膜瓣时的90°侧切边缘及基质床表面

随着技术的发展,飞秒激光在角膜屈光矫正领域中,不仅制作平面或曲面的角膜切割,形成一角膜瓣,且可以在各个方位、各个角度进行各个方向切割,目前已开展的应用飞秒激光制作一透镜,再将透镜从同样由飞秒激光制作的位于角膜周边的微小切口处取出,用以矫正近视和散光等,被称为飞秒激光小切口角膜微透镜取出术(SMILE手术),即利用飞秒激光达到屈光性的组织切除,已初步显示出其较好的临床效果。

由于SMILE手术可以将活体的角膜透镜取出,使飞秒激光与正常角膜组织作用后的活体研究成为可能。SMILE手术是通过上下两层的扫描,在角膜组织中制作一透镜来矫正屈光不正,而激光对扫描平面的上方和下方组织作用基本相同。因此,通过对手术中取出的角膜透镜的前表面和后表面超微结构的分析,可以反映出飞秒激光对正常活体人眼角膜组织的瞬间损伤作用。

在光学显微镜下,角膜透镜的前后表面可见一层组织深染,可能是激光扫描时在组织表面产生的热损伤(图8)。但是这层深染的组织很薄,厚度在nm量级,并且没有发现组织深部有深染的组织损伤。分析原因是由于此类飞秒激光的单脉冲能量极低,并且脉冲时间极短,因此在聚焦于角膜组织后的激光热效应和热传递较小,对角膜组织的瞬间热损伤和机械损伤作用可以降到最低。在对透镜的前后表面规则程度的研究中,光镜、扫描电镜和透射电镜下均显示透镜的前表面光滑程度较后表面高,后表面在光镜下表现为毛刷样不规则;扫描电镜下可看到大量组织桥和断续的胶原纤维;透射电镜显示,透镜前表面切割边缘呈线状,而后表面切割边缘呈不规则状(图8~10)。可能为人眼角膜基质的致密程度在不同部位有所差异的缘故,越靠近前弹力层的前部基质越较为致密,而越往后部,基质板层之间的致密性越低,胶原纤维排列较为松散的部位发生光爆破作用时形成的气泡垂直半径与水平半径的比大于致密排列的部位。最终形成气泡融合的平面将会由于气泡之间的不完全融合而表现的不规则。

角膜透镜在光学显微镜下的表现

图8 角膜透镜在光学显微镜下的表现

角膜透镜前后表面的规则性比较

图9 角膜透镜前后表面的规则性比较

透射电镜下角膜透镜边缘细胞结构的改变

图10 透射电镜下角膜透镜边缘细胞结构的改变

透射电镜下局部胶原纤维呈波纹样排列,距离切削表面的细胞结构变化较明显,细胞膜破裂,细胞固化,并且固化细胞被断裂成若干碎块。角膜基质细胞有的仅留有残骸,细胞原占据空间成为裂隙(图10)。因角膜透镜边缘是飞秒激光的聚焦区,而飞秒激光的聚焦区光斑较小,在1μm左右。所以细胞结构的改变主要发生于透镜的边缘部位,而对透镜中央部分组织细胞损伤较轻。在临床上,我们观察到应用低能量的VisuMax飞秒激光完成小切口基质内透镜取出术后,患者的角膜均较透明,较少出现Haze等细胞反应,也无角膜混浊发生。可能是因为低能量的飞秒激光对角膜组织产生的瞬间作用对术后的伤口愈合反应影响较小。

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