细菌的耐药机制

耐药性可分为固有耐药性和获得耐药性。固有耐药性是染色体介导的、代代相传的天然耐药性,如细菌对青霉素。获得耐药性多由质粒介导,但染色体也可介导。细菌主要通过以下几种方式抵制抗菌药物作用:

  1. 产生灭活酶或钝化酶,使抗菌药物失活或结构改变;
  2. 抗菌药物作用靶位改变或数目改变,使之不与抗菌药物结合;
  3. 改变细菌细胞壁的通透性,使之不能进入菌体内;
  4. 通过主动外排作用,将药物排出菌体之外;
  5. 细菌分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包绕形成细菌生物被膜。

这些耐药机制不是相互孤立存在的,两个或更多种不同的机制相互作用决定一种细菌对一种抗菌药物的耐药水平。现分别介绍如下。

细菌整合子系统

近来的研究显示,整合子在细菌获得抗菌药物耐药性机制中也起了重要作用。整合子(integron)是捕获外源基因并使之转变为功能性基因的表达单位,通过转座子和接合质粒在细菌中传播的遗传物质。整合子的基本结构由编码整合酶(integrase)的IntI基因、2个基因重组位点attI和attc、启动子和耐药基因盒组成。耐药基因盒是单一的可移动的DNA片段,通常以独立的状态存在,只有当它被整合子捕获并整合到整合子中才能转录。基因盒是由一个开放阅读框(ORF)和一个反向不完全重复序列(长度59 bp)组成,编码整合酶的识别位点。目前发现有4种类型的整合子与编码抗生素的耐药基因相关:Ⅰ类整合子是最常见的,它的整合酶含有337个氨基酸。5'保守端有Ⅰ类整合子基因和启动子,大多数3'保守端有3个ORF基冈——季铵化合物及溴乙铵的耐药基因、磺胺耐药基因及功能不明的ORF基因,在肺炎克雷白杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、弗劳地枸橼酸杆菌感染的患者都可检出Ⅰ类整合子。Ⅱ类整合子位于转座子In7及其衍生物上,其整合酶约有318个氨基酸残基。5'保守端Ⅱ类整合子的基因产物与Ⅰ类整合子的产物有46%的同源性。Ⅲ类整合子的IntI3基因与intI有61.0%的同源性,整合酶Ⅲ含320个氨基酸。Ⅳ类整合子基因产物与Ⅰ类整合子产物有45.5%的同源性。Ⅳ类整合子含179个基因盒,又称为超级整合子(Super Integron),它除具有耐药基因外,还具有致病基因,如编码毒素、血凝素和脂蛋白的基因。

基因盒常以环状DNA的形式独立存在,当它被整合子捕获并整合到整合子中才能得到表达。目前已确定70多个基因盒,大多有β-内酰胺类、氨基糖甙类、甲氨嘧啶类、氯霉素、链霉素耐药基因,它们的抗性基因分别是aadA、dfrA1、sut1、qucE、blap1、sat、blaCTX-M-2等。常见的有以下几种:

  1. d基因盒,编码氨基糖苷类的耐药性。其中aadB基因传递对庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐药性。
  2. dfr基因盒,编码甲氧磺胺嘧啶类的耐药。
  3. 编码β-内酰胺酶和超广谱B-内酰胺酶的基因盒,此类基因发现得越来越多。
  4. 其他基因盒,如eat基因编码对氯霉素的耐药。aac基闲编码对氨基糖苷类的耐药,aar基因编码对利福平的耐药。ere基因编码对红霉素的耐药。

产生灭活酶或钝化酶

细菌可产生灭活酶或钝化酶,并以此来破坏各种抗菌药物。目前细菌产生的灭活酶或钝化酶主要是β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶、氯霉素乙酰转移酶和大环内酯类、林克霉素类、链阳菌素(MIS)类抗菌药物钝化酶。

目前对β-内酰胺酶研究最为深入。其类型、底物广度及耐药程度均以惊人的速度迅速增长。β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶,可降解β-内酰胺类抗菌药物的β-内酰胺环,使其失去活性,无法与作用靶点PBPs结合。另外,β-内酰胺环自身张力较大。酰胺键的内在稳定性弱,易受到β-内酰胺酶的攻击。细菌产生β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因。β-内酰胺酶分为染色体介导酶和耐药质粒介导酶两大类,以其水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶和超广谱酶4种。由革兰阳性菌产生的β-内酰胺酶以葡萄球菌属产生的青霉素酶最重要。而在革兰阴性菌中,超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)越来越受到重视,主要是因肠杆菌科细菌如肺炎克雷白杆菌、大肠埃希菌等细菌产生的ESBLs,对甲氧砸氨基β-内酰胺类抗菌药物如头孢他啶、头孢噻肟,以及单氨类抗菌药物如氨曲南等药物一种或多种耐药。ESBLs大部分由质粒介导,包括TEM型及SHV型衍生的β-内酰胺酶、PER型酶、CTX型酶及K1、TOHO-1、MEN-1、VEB-1等型酶。近年来,由于β-内酰胺酶抑制剂或钝化剂的应用,使部分β-内酰胺酶对抑制剂和钝化剂也产生了相应的耐药性,因此β-内酰胺酶抑制剂耐受型(lnhibitor Resistant Type, IRT)酶对β-内酰胺类抗菌药物与酶抑制剂的联合用药也表现出耐药性。

细菌本身还可以表达β-内酰胺酶。该酶能够水解。β-内酰胺酶是一群酶,根据分子学结构可将其分为四群:

  1. A群β-内酰胺酶为丝氨酸蛋白酶,主要作用于青霉素类药物,编码基因位于染色体或质粒上,可从一个细菌转移至另一个细菌;
  2. B群β-内酰胺酶为金属酶,其活性部位为结合锌离子的硫醇基;
  3. C群β-内酰胺酶主要是头孢菌素酶,存在于革兰阴性菌染色体上,可被诱导或重组;
  4. D群β-内酰胺酶为苯唑西林酶。大量试验证实,β-内酰胺类抗生素和细胞壁前体的存在都可以诱导β-内酰胺酶的合成,其作用机制为β-内酰胺酶与催化细菌细胞壁肽聚糖合成的青霉素结合蛋白空间结构相似,可竞争性水解药物β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性,其水解效率是细菌耐药性的主要决定因子。

已发现所有细菌以及衣原体等的细胞膜上均具有一些能与青霉素和其他B一内酰胺类抗生素结合的蛋白,即青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Proteins,PBPs)。这些存在于细菌细胞内膜上的青霉素结合蛋白是青霉素作用的靶分子。PBPs系分子量为4万到12万的膜蛋白,是细菌细胞壁合成过程中不可或缺的具有催化活性的D,D-肽酶,如转肽酶、羧肽酶、肽链内切酶等,它们是在细菌生长过程中起重要作用的蛋白质。不同细菌PBPs种类及数量有很大差异,例如金黄色葡萄球菌有4种PBPs,大肠杆菌则至少有7种。青霉素和其他β-内酰胺类抗生素作为PBPs底物的结构类似物,竞争性地与酶活性位点共价结合,从而抑制PBPs,干扰细菌细胞壁的合成,以达到杀灭细菌的作用。细菌对β-内酰胺类的敏感性主要由于其PBPs对这类药物具有高亲和力,各种PBPs与不同β-内酰胺类的亲和力有所不同。在长期的药物作用下,细菌为了生存,其基因组发生突变,产生新的青霉素结合蛋白与青霉素的结合作用降低,即细菌对青霉素表现出一定的耐药性。

改变靶位结构

改变靶位结构主要包括以下途径:靶蛋白的结构改变,可使抗菌药物与细菌细胞的亲和力降低。如DNA促旋酶或拓扑异构酶活性位点的改变,可使氟喹诺酮类的亲和力降低,从而使病原菌对喹诺酮类抗菌药物耐药。增加靶蛋白的数量,在药物存在的同时仍有足够量的靶蛋白可以维持微生物的正常形态和功能:新合成敏感菌所没有的、功能正常的、与抗菌药物亲和力低的靶蛋白。大环内酯类、林可霉素、链阳菌素、四环素类、氨基糖苷类药物主要通过与细菌核糖体结合,抑制细菌蛋白质合成,而发挥抗菌作用。细菌核糖体由大亚基(50s)、小亚基(30s)构成,亚基中mRNA及蛋白质的改变,可引起与抗菌药物亲和力的变化,而产生对上述几类药物的耐药性。

降低外膜的通透性

外膜孔蛋白量的减少或孔径减小及细胞壁增厚等均会降低外膜的通透性,使药物不易进入靶部位。外膜孔蛋白F是β-内酰胺类、四环素类、喹诺酮类和氯霉素等药物通过外膜到达靶部位的大门,外膜孔蛋白F的丢失,可产生对上述药物的多重耐药。多数情况下,外膜孔蛋白缺失并不是主要的耐药原因,但可降低细菌对抗菌药物的敏感性。在其他耐药机理存在的情况下,可明显提高耐药程度。多数β-内酰胺类抗菌药物对外膜孔蛋白的通透率较低,一旦发生外膜孔蛋白缺失或减少就会造成该类药物进入细菌细胞内的量明显减少,引起明显的耐药。而氨基糖苷类等尚有其他通道进入胞内,故受影响不大。文献报道,利用插入序列干扰肺炎克雷白杆菌的外膜孔蛋白OmpK36合成造成外膜OmpK36缺失,导致肺炎克雷白杆菌对头孢西丁的耐药性增加,证实了外膜孔蛋白缺失可直接导致肺炎克雷白杆菌产生耐药性。

细胞壁增厚是金黄色葡萄球菌对糖肽类抗菌药物产生耐药的最重要机制。目前临床分离的万古霉素中度敏感金黄色葡萄球菌菌株都存在细胞壁的明显增厚的情况,主要是肽聚糖层数增加,可达30~40层,远超过一般金黄色葡萄球菌的20层。有人用透视电子显微镜对16株万古霉素中敏金黄色葡萄球菌进行观察,发现VISA细胞壁平均厚度为31.3 nm。而万古霉素敏感金黄色葡萄球菌(VSSA)细胞壁平均厚度仅为23.4 nm,两者间存在明显差别。当VISA对万古霉素恢复敏感后(MIC<4 mg/L),细胞壁的厚度降低且至VSSA菌株细胞壁的厚度。如果用万古霉素对这些恢复了敏感性的菌株进行选择,细菌对万古霉素的敏感性又降至原先水平,同时出现细胞壁的增厚。

生物被膜

生物被膜亦称菌膜,是细菌为适应自然环境、有利于生存而特有的生命现象。当细菌吸附于惰性物体(如生物医学材料或机体黏膜表面后),就会分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物,使细菌相互粘连,从而保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃避宿主的免疫。在临床上,常常导致感染持久不愈或急性发作。

目前认为生物被膜耐药机制可能有:①物理屏障作用。生物膜的黏性胞外基质是生物膜的主要成分,厚厚的黏性胞外基质如同装甲一般将细菌包裹起来,抗菌药物在生物膜中的扩散速度远慢于在水溶液中的扩散速度。Ander等人报道生物被膜内的肺炎克雷白杆菌局部的葡萄糖及氧等营养物质浓度明显较外界低,导致其生长缓慢甚至停滞,从而产生对环丙沙星及氨苄西林的耐药性。②生物被膜菌还有可能因为接触抗菌药物浓度低,比浮游生长菌有更多的机会被诱导产生β-内酰胺酶而引起耐药。在生物被膜内的细菌生长率降低。一般情况下抗菌药物作用于细菌的最佳时期是细菌的快速生长期,因此降低生长率在生物被膜耐药中起着十分重要的作用。③对抗免疫清除作用。生物膜的屏障功能具有明显的刘、抗机体免疫系统的作用。④细菌群体感应的作用。从浮游状态到细菌生物膜,菌经历了从低密度到高密度、从无组织状态到有组织状态的过程。在细菌完成了吸附后,细菌群体感应机制就在生物膜的形成中发挥重要作用。革兰氏阳性细菌主要采用小分子多肽,而革兰阴性细菌则使用小分子酯类作为信息交流分子,群体感应机制被激活后,统一协调细菌的行动,共同完成游离细菌所无法完成的复杂工作。例如,浮游状态的细菌在低密度状况下毒力较低,而在高密度时毒力增强,容易抑制机体的免疫系统。

加强主动外排系统

外排系统由3个蛋白组成,即转运子、附加蛋白和外膜蛋白,三者缺一不可,故称为三联外排系统(Tripartite Efflux System)。转运子位于胞浆膜,在系统中起泵的作用;外膜蛋白类似于孔蛋白,位于外膜(阴性菌)或细胞壁(阳性菌),是药物被泵出细胞的外膜通道。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和空肠弯曲杆菌等均有主动外排系统。经主动外排系统引起耐药的抗菌药物有四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素和β-内酰胺类等。主动外排系统与细菌形成多重耐药性有关,由于这种系统的转运底物大多非常广泛,而且同一株细菌可存在多种主动外排系统,因此可导致细菌产生对各种结构完全不同的抗茼药物的耐药,即多重耐药。

总之,细菌的耐药机制非常复杂,同一种耐药机制可存在于不同的耐药菌株中,不同的机制可同时存在于同一菌株内协同发挥作用。因此必须加强各地区的细菌及其耐药的监测,了解各地区的主要病原菌及其耐药性,减少抗菌药物选择的压力及经验性使用抗菌药物,合理使用抗菌药物,减缓细菌耐药性的产生。

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