皮肤药效动力学

在药理学领域中,药效动力学(pharmacodynamic,简称药效学)是一门研究药物分子如何作用于机体生物大分子,药物浓度与效应的关系,以及其效应的作用原理的科学。虽然皮肤病的病理环节常不只限于皮肤,但药物分子与皮肤生物大分子之间的相互作用和引起皮肤相应的生理、病理及生化代谢的变化,是皮肤药效学研究的主题。

在临床医学包括皮肤病学的领域中,凡研究有关化合物、提取物、生物制剂或药物的生物活性的实验研究,基本上都属于药效学范围或涉及药效学问题。这是一门应用性强、令人感兴趣,又是薄弱和容易出差错的领域;是一门指导性强,又可能引起误导的学问。既然药效学的任务是发现和评价药物,但无论是临床前研究阶段的实验发现,或是临床应用阶段发现后用实验方法进行验证和确证,药效学的研究手段都是不可替代的。所以说,新药理活性的发现和新化合物的发现是新药发明的两大支柱。

药物是治疗学的主要手段,也是代表治疗学进展的主要指标;新药的发现和再发现有许多途径,包括实验途径和临床途径;新药的研制过程又分为临床前阶段和临床阶段;临床前研制包括药学(药物化学、制剂、药物分析、质量标准研究)、药效学、药动学、毒理学(安全性评价)等研究内容。这些都是药物治疗学的基础学问。

新药上市后,临床医师通常还会在临床上或实验上对该药的有效性、安全性作进一步的再评价;或与新、老药物作定性、定量的比较;或对具体适应证的作用原理作深入探讨;或从不同方面评价该药的实用价值和市场地位;或又发现新的用途和新的适应证。这些都是临床医师参与药效学研究的具体内容,也是临床医学杂志发表的学术论文的主要内容之一。因此,参与者都应充分了解药效学研究的特点和要求。

药效学研究有赖于有无能起预示作用的药效学方法,后者又有赖于对疾病发病机制的了解及病理生理环节(即药物作用靶位)的揭示,同时又必须具备相应的检测技术和工具去加以实施,诸多条件缺一不可。但现状是,在发现、评价和研制皮肤病新药及探讨老药在皮肤病临床的新用途和治疗学的新原理时,具备指示性、特异性、实用性的药效评价方法还不多。许多文献和方法学专著报道了一些皮肤病模型和方法,迄今最易复制和检测的仍是感染性皮肤病,包括化脓菌、真菌、原虫、性病病原体以及疱疹病毒等可培养病毒等,这类药效评价的模型和方法多已形成规范。皮肤免疫反应,皮肤炎症,血管舒缩反应,皮脂腺、毛囊形态和功能,细胞增殖和分化,烫伤及伤口愈合,经皮穿透和吸收,光毒、光敏反应等病理环节方面亦有值得借鉴或可行的实验方法。

但是,已有的传统的实验方法还多少存在理论依据不足或过时,或着重形态学模拟而对疾病本质涉及较浅,或与病理生理环节间缺乏联系,或在模拟疾病发病与药物作用的分子机制间有较大距离,因而预示性受到限制。特别是人和动物皮肤器官在种系上存在较大的结构和功能差异,这使研究皮肤为靶点的药效学、药代动力学和毒理学的实验结果都容易出现偏差。可以说,除了上述感染性模型外,能模拟的、自发的、共生的,以及用转基因和裸鼠移植等方法复制的皮肤病整体模型等非常有限,专属性也差,或难以实用。

显而易见,皮肤病药效学方法的更新和确立,非常依赖于皮肤病学的基础研究,特别是病理生理和发病机制研究的进展和突破。因此,问题解决的起点还得从皮肤病基础研究的进展开始。

疾病发病的主要病理环节及部位是药物作用的靶。现代皮肤病学有越来越多的证据表明,大多数皮肤病都是全身系统病变的皮肤局部表现,其病因可以不在局部,其病理生理环节和调控因子可不完全、甚至不主要在皮损内部,因而药物作用的靶并不只局限于皮损内,而皮损往往是疾病表现的集中部位。另一方面,皮肤病治疗药物包括局部和系统给药两大类,把皮肤病治疗药物仅仅或主要理解为皮肤外用药是不全面的。局部或系统给药仅仅表明不同的给药途径,途径是方式,不是目的。因此,治疗观念上首先要明确靶在哪里,所用的治疗措施是对因还是对症,是主要还是辅助,是直接还是间接。整体概念在皮肤病药效学和治疗学中不仅重要,而且有时可成为药效和疗效试验成败的关键。

药物治疗学的困惑之处是迄今大多数皮肤病的发病机制还未弄清或未完全弄清,伴随而来的是药物的作用靶位不明或不甚明了,这对发展和评价新药、用好老药带来极大的障碍。另一方面,皮肤药理学和临床治疗学研究的着眼点如果不深入到分子靶位上,则无法在质上有所突破。在这里,皮肤分子药理学的研究是举足轻重的。

药效学方法是对发病机制及环节的模拟,所以研究药效学方法应当以该类疾病的病理生理调查研究为起点,以临床适应证为目标。从体内到体外、从形态到功能、从大体到分子、从现象到本质,其模拟的程度有着形似到神似的区别。

必须指出,无论在哪个临床专业领域,药效学研究和应用总是处在动态的发展过程中,这是一门很活跃的学问,需要多学科的知识,以及需要科技的投入和支撑。在实践中始终要处理好药效学理论依据的先进性和方法学应用的成熟性的关系。相信药效学的门槛造得高一点和牢一点,药物有效性研究的质量就会可靠一点和好一点。

模型

药效模型是指在人体外,利用整体动物、离体器官、组织、细胞、分子为材料,用实验方法,对疾病发病机制整体或病理生理环节的模拟,形成实验方法系统,替代和充当相关适应证的某些病理表现,作为药物作用的靶。当被检物质加入该系统后,即可对模拟的病理表现进行实验性干预,从而发现、筛选、评价该物质的相关生物活性,并对其命运起预测作用。

模型的水平和模拟的程度,关系着药效发现的速度和精度。评价模型及其预测结果常用指示性、敏感性、特异性、稳定性、实用性等概念来衡量。顾名思义,模型的确立、选择和应用,关键在针对性强、设计精密和反应灵敏等定性、定量的程度上,而不完全取决于仪器的档次和技术方法的先进性,尽管这两点也很重要;至于技术的复杂性和难度,则要看目的和需要了。

模型又分整体(体内)模型和离体(体外)模型,主要区别在于是在体内给药(包括皮肤局部给药)还是在体外给药。整体病理模型的完善化的极限接近于临床适应证,但事实上—模一样是不可能的。个别文章或报告曾提出过所谓“人体模型”,并对之进行药物试验,这是对模型的目的、功能和意义的极大误解。体内试验是重要的,新药主要药效作用研究应当用体内、体外两种以上试验获得证明。问题是,如上所述,皮肤病整体模型或符合要求的整体模型相对其他疾病系统少之又少,而模拟近乎于疾病原型的整体模型是不能强求的,以降低标准、模糊与发病机制的关系的模型更不可取,因其指导性和误导性的巨大差异也由此产生。还需强调的是,对皮肤病的体内模型还要注意形似还是神似的问题,有时形态学(肥厚、色素改变、炎症等)与临床很相像,但发生机制和自然病程可不同或完全不同,由此产生的药效可能是假象。

目前在皮肤病药效实验领域,体外模型似乎更现实可行。体外实验的特点是分析性强,优点在于其比较接近或可直接针对选择的生物大分子靶点,更直接地反映药物作用的本质。对于无法建立整体模型的疾病,有时利用其可模拟的病理生理环节,将发病机制网络已知的部分分解而设计的体外方法(包括细胞、分子和基因水平的方法),至少在某些环节上,病理生理现象吻合度较高,并可开拓深度和广度,甚至可涉及机制。如被检物质生成的增加或减少;生理功能的兴奋或抑制;受体的选择、激动或拮抗、可逆或不可逆结合;酶与底物的直接作用、酶抑制剂的作用强度和效价等。蛋白、核酸、基因、受体、酶等靶点,用体外或生理模型常可直接筛出。一些酶反应,抗微生物、抗原虫药物的初筛可先在试管、平皿中进行。皮肤病的生理、病理和药理体外试验还可利用人体皮肤、皮损和血细胞等材料以减少或消除种系差异。当然,反过来需要在定性、定量上研究所用体外方法及其结果是否与整体发病机制网络反应相符合,以及体外和体内剂量(浓度)的差异和联系。体外模型还要注意病理状态,如抗细胞增殖的细胞是否处于异常增殖状态,抗细胞表达的细胞因子是基础(自然)表达还是诱导剂诱导的异常表达等。如果药物抑制的是未经诱导的基础表达,则结果显示的是一种生理抑制的副作用,而不是药理抑制的药效作用。

模型(特别是体内模型)的选择一定要实事求是。如果是受发病机制不明或药效方法研究滞后的影响而做出的不理想的选择是一种无奈,那么脱离实际、形式上套用、追求似是而非的模型和结果则是一种学术上的做假和研究上的不负责任行为。无视客观可行性,非体内模型不可的想法亦是不实际、不可取的。模型的选择是药效学研究的一个重要环节,而更重要的是药效学方法是随着疾病发病机制研究的进展而不断更新的,因此要跟踪模拟疾病的病理生理的新发现,这是检验模型方法水平和可靠性的一面镜子;另一方面,药效学研究与以探讨和创新为目的的学术研究亦不同,前者的理论方法都应强调成熟,具体结果不宜有太多“可能是”等推理性结论。

药效模型的确立必须符合药效作用原理与疾病发病原理相印证的原则。例如早期由于对心绞痛的病理生理认识不足,抗心绞痛药的药效模型的设计概念是基于促进冠状动脉扩张、增加心肌供氧量;而后期的概念是基于减轻心脏负担、降低心肌耗氧量。前后研究了很多模型,但是走了二十多年的弯路,耽误了新药的发现与治疗学的进展。以皮肤病领域研究热点的银屑病药效方法为例,基于传统的上皮细胞异常增殖发病机制概念,既往筛选抗银屑病药的经典模型常选用抑制小鼠阴道上皮细胞周期及增殖的方法。现在看来,这与银屑病现代发病机制概念已有显著差距。受雌性激素调控的正常小鼠阴道上皮周期改变的机制与人银屑病的上皮细胞异常的增殖和分化受特定的基因和生物因子调控完全不同,用小鼠阴道上皮细胞代替人皮肤上皮角质形成细胞,其细胞的生物学特性有显著种系及解剖部位的差异。上皮角质形成细胞不是银屑病发病最关键的细胞,其增殖和分化异常仅是临床和病理较集中的表现,是继发的,如用小鼠阴道上皮法去筛选抗银屑病药物,无疑会筛选细胞抑制剂,而用本模型去筛选作用机制与银屑病发病机制最吻合的环孢素就不可能被筛出,因为药理浓度的环孢素对上皮细胞增殖并无抑制作用。

必须指出,由于物种间的差异,体内、外环境条件的差异,以及药物和病原体等有关的固有因素,上述同一个模型在不同动物之间,在体内、体外试验结果之间,在临床前试验与临床试验间,可能或必然会存在差别,甚至出现截然相反的结果。例如,许多药物,特别是抗微生物药物,在试管筛选与感染动物间、在不同实验动物间,及在人与实验动物间的定性或定量差别很常见,所以结论只能在综合筛选程序完成后才能谨慎地作出。以体内代谢产物为活性物质的药物(如环磷酰胺),体外试验肯定没有活性;以细胞内寄生的病原体(如单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)或细胞内代谢的药物(如阿昔洛韦、喷昔洛韦等),以及离开宿主体外很难生存的病原体(如疟原虫、疥虫、螨虫、麻风杆菌等)的实验,就必须符合其相应特点和条件才能得出真实和可靠的结果。

指标

指标是指模型的生理、病理、病理生理、生化、代谢参数以及宏观症状、体征表现在药物作用下的变化标志。它是药效评价的定性、定量判断依据。在药效模型符合要求的情况下,指标受关注的问题是其敏感性和稳定性,以及其判断标准。敏感性即灵敏度,指标的变化应当敏锐地反映上述微观和宏观病变及药物干预后的改变的程度。如果敏感性差,就会出现假阴性,这意味着漏筛和低估的可能性;如果敏感性过高,就会出现假阳性,这意味着鱼目混珠,埋下了评价的隐患。因此这两种后果都应尽量避免,与模型、方法相关的问题都要控制好。

指标的敏感性除取决于模型和方法的本身外,还容易受实验条件和人为因素的影响。例如,—个体外检测药物对细胞表达某因子的影响的试验,材料和方法上涉及培养基、细胞株、培养条件、细胞生长曲线、诱导剂浓度及时间、加药时间、某因子的收获时间和检测方法、反应剂及核素的掺人时间等环节,这些环节是否都找到最适或最佳条件,所有试剂的质量、纯度、期效,检测仪器的性能、灵敏度,以及实验室条件和操作人员是否符合标准操作规程(SOP)要求,和是否存在技术或系统误差等问题,只要其中某个环节不理想都可能影响敏感性及影响到定性、定量结果。对一些作用不很明确的药物(如免疫增强剂,抗肿瘤或抗病毒增强剂)的检测,无论是实验或临床试验,如设计受试药以外的基础的、对症的或辅助治疗的药物或处置,都应当控制在不影响检测受试药的指标敏感性的范围内。

稳定性即重现性,重现性不但体现在同一个实验方法系统的重复测定过程中,也体现在同一个指标用不同方法测定的结果中。用某一方法测定某指标时,一般都用几次测定并取其均值来提高精密度。如果稳定性差,药效结果的可靠性和可信度当然也差。

指标的判断标准是在模型和指标确立的基础上订立的一个灵敏度范围。标准的制订,一方面是用已知阳性药物及阴性药物作对照,通过实验考核模型或方法对病变的揭示能力和(或)对药效的反应能力,客观上确定出一个取舍范围,很多临床和实验的正常值指标都是这样确定;另一方面是在可取的范围内,按照实际的需求灵活地确定取舍标准,很多化合物或药物的筛选和评价都是这样确定。后一种情况一如准入门槛的高低,例如抗艾滋病药、抗恶性肿瘤药、抗HPV药、抗银屑病药、选择性抗脂氧合酶药、抗色素异常药、第一代新结构等化合物或药物,因现实需要、研发滞后、缺乏理想药物,或指望其结构的更新换代而发挥其衍生物的潜力等原因,入选标准宜适当放宽些;相反,一些抗化脓菌药、抗真菌药、甾体激素药、抗环氧合酶药,或结构类型和作用机制与已知药类同,或不具备特色和优点及未能明显超出现有药物水平的化合物或药物,入选标准就应订得高一些。

这些原则不仅用于新药临床前评价,同样也适用于临床评价及上市后的药物再评价。但在药物评价和再评价的全过程中,通常并不是单方面或单个的指标能解决的,而需要多方面、多指标进行综合评价。例如,地蒽酚外用抗银屑病疗效确实,但有刺激性,当结构改造为II-酰一地蒽酚后,刺激性减轻,但疗效亦降低,提示刺激与疗效相关,不能用刺激性单指标来评价。

以抗病毒药物为例,阿昔洛韦(ACV)具有明确的抗疱疹病毒作用,其作用机制为抑制DNA聚合酶,其口服生物利用度约20%,必须每天4-5次给药,半衰期1~2小时,可静脉滴注,但每天至少3次;其前体药万昔洛韦(VCV)口服生物利用度约70%,体内释出ACV,因而形成VCV-ACV组合。新的组合泛昔洛韦(FCV)与喷昔洛韦(PCV)研制思路相同,其区别和选择的指标在哪里?如果从体外抗疱疹病毒药效指标来比较,则PCV与ACV的作用、效价、机制与安全性基本相同;外用给药,每天涂病灶处2-3次,二者差别不显著。但在药代动力学上的一个重要区别在于PCV在感染细胞内的半衰期达11-20小时,比ACV长10倍以上,因此在FCV口服时或PCV静脉给药时,给药次数可减至每日2次,给药剂量亦可适当降低。综合指标分析提示:ACV与PCV药效相同,药代不同;体外作用相同,体内作用不同;因而剂量和给药方案不同。又因为作用原理相同,所以提示该系列仅为量变,并未出现质的变化。

模型的药效指标与临床适应证的疗效指标虽然不可能完全一样,但都应具备定性、定量评价药效或疗效的能力,如不作综合分析和评价,仅在个别或少数模型和指标上下简单的和绝对的结论,是十分不妥当的。指标的应用还应当具备实在的意义。在杂志中常可看到,许多论著习惯将有关指标的药效参数与不处理或空白对照组作统计学比较,检出了差异性,就下一个有效的结论,并在讨论中推论到应用的前景。假设空白对照组反应率是1 0%,某剂量组的反应率是25%,组间的差异可能有显著性,但作为药效指标,一个效能仅为25%的药效反应,是很难在临床上体现出疗效的。统计学上没有错,但药效学上证据太苍白了。

剂量

新药研究的全过程,从药学研究到临床试验,定量概念都极其重要,尤其是临床前药效、药代及毒理试验,没有定量或定量不可靠,就无法评价药物的有效性、安全性和可控性,所有数据就毫无意义。临床剂量的确定是临床前综合研究的结果,但临床用药仍然存在定量控制的问题。定量是核心问题,任何的一丝疏忽都会引起一系列连锁反应的后果。临床前药效学的定量判断,不但要回答有无药效及程度如何,还应当求出可比较效价,还要预测在临床上是否能有同样的质反应及量反应如何。但在皮肤科杂志上发表的与药效学实验研究及药物评价有关的论文中,在注意基本的定量要求及考虑数据的实用性方面还很不够。

定量是从体内、体外给药的剂量或浓度开始的。体内针对皮肤的非局部给药处理与常规的系统给药处理没有区别,而皮肤病外用药却有些特殊规律。皮肤局部给药是体内给药,但与其他体内给药用重量(如mg)表示剂量不同,其剂量常用浓度(g%或W/W)来表示。皮肤病外用药的剂量(浓度)的确定受制于许多因素,如果简单地从制剂浓度、涂药的重量或体积来衡量,常会得出一个不真实的剂量或作出错误的判断。一个定量的制剂涂于皮肤表面后,它的真实剂量受众多因素影响,诸如:

  1. 不同种系、不同部位的皮肤角质层厚度;
  2. 不同疾病状态下角质层的完整性和给药时角质层的物理状态(尤其是水合状态);
  3. 药物的理化性质,溶解度及亲脂、亲水性
  4. 基质的性状和特性,是否有理化的促进穿透作用;
  5. 制剂中药物的浓度;
  6. 制剂与皮肤的接触面积、饱和度和时间;
  7. 涂药后是否封包;
  8. 药物从基质中的释放度等。

这些因素共同制约着外用药物经皮穿透的量。实际与皮肤有效接触、能经皮穿透并有可能产生药效的制剂量约2 mg/cm2,其中所含的治疗药物的量才是局部用药的真正剂量。由此不难看出,如果药物、处方、对象都符合要求和条件固定,剂量的可调节因素是药物浓度和涂药面积。如果上述条件均固定,那么药物从制剂基质中释出的、在线性范围内的、不同浓度的药量才能代表一个相对的剂量,后者经皮穿透、有效吸收形成的皮内浓度,才能与血药浓度和组织浓度一样可以作为剂量一效应的可靠定量指标,以及可以确定和维持该药在皮损内的治疗窗(therapeutic window)。当然,进入皮内的药物只有到达靶位,并与相应生物大分子结合才能产生药理效应。

皮肤局部用药只针对皮肤,所以皮内浓度是局部用药的中心问题。局部用药在药物最终作用于皮损靶位的过程中,经受了经皮药代动力学处置,形成一个动态的皮内浓度,后者很大程度上决定着药效和毒性的结果。在局部用药的药效、毒理及制剂研究中,应当按需要和可能估算、测定和参考皮内浓度数据,正如系统给药治疗皮肤病应参考系统药代动力学参数、血药浓度和皮肤组织浓度数据一样。

动物和人的局部用药研究(包括制剂制备、药效试验、毒理试验,乃至临床试验)常见的与剂量相关的存在问题是:

  1. 简单地以增加制剂浓度来增加剂量,不考虑制剂是否合乎药剂学制备的理化、性状要求;
  2. 简单地以药物的重量或体积表示剂量,忽视单位皮肤面积的实际承受量;
  3. 以千克体重给药量表示剂量,完全模糊了局部给药的剂量概念;
  4. 动物皮肤给药后未能固定头部及非单笼饲养,不能排除经口自舔及互舔,给药途径偏差可使结果不可靠;
  5. 未估计使用正常动物、完整皮肤进行试验对预测疾病及皮损状态的实际偏差,包括大分子药物在临床上对破损皮肤与在实验上对动物正常皮肤的不同透皮结果;
  6. 无法模拟皮损状态或不能真实模拟(如以划痕代表破损)造成结果的似是而非;
  7. 非上市(如医院内)制剂在复方配伍、处方组成、相互影响、稳定性、保质期等方面的问题等。

这些问题可直接影响到临床前药效及安全性评价及临床试验的可靠性,并非是可忽视的问题。毕竟,药效或疗效是指动物或人在能接受的有效和安全的剂量下所发生的结果,这意味着剂量概念是定量的、有严格限定的。这又恰恰是许多药效学相关试验所未注意到、未做到或易混淆的。药效学研究,除了上述动物和人的局部用药研究外,体外或其他途径的体内实验研究还有一些与剂量(浓度)相关的问题需要强调。

首先,实验剂量(浓度)范围的确定一定要有依据,范围的下线应从不起效的剂量(浓度)做起,以一定的倍数或间比提升,直到药效不再增加时为止,这是药效数据的可取范围。

其次,实测数据要按药效学研究要求和规律予以加工,如制表、作图、计算和统计学处理等。若以横坐标为量、纵坐标为效作图,可得不对称的S型量-效曲线,如用对数或双对数(概率单位)作图,则可成对称的S型曲线或直线图形,此时被测药物的药效剂量范围、量-效反应、半数量-效、效价、效能都可见端倪。通过直线回归方程计算,如果相关系数γ有显著性差异,说明Y值的变异与回归线有关,就容易得到准确的效价强度值(ED50或IC50)和任一剂量下的效价强度值(如ED99或IC99等)数据。

体外或体内求得的效价强度值是重要的,它直接表明这个至少能达到50%效能的药效反应是确实的,进而应充分利用效价强度值提供的信息与阳性对照药作效价强度值比较,可得到两者效价及效能的比较信息;与50%或1%动物致死量(或细胞毒性浓度)[LD50或LD1(或TC50或TC50)]比较,可得到治疗指数(TI=LD50/ED50或TC50/IC50)及可靠安全系数(CSF=LD1/ED99或TC1/IC99)的信息。药效剂量(浓度)范围的设计是针对主要药效学研究的,后者是针对临床适应证的。药效学研究所指的体内药理浓度,是指人在有效、安全剂量下体内不同部位(尤其是病变靶位)和不同时间可达到的药物浓度,如果实验设计和求得的浓度在该范围之外,或者实验浓度与此不相关,那么该药效学试验将起不到任何预测作用。所以体外试验所求得的有效浓度(如IC90)应与体内血药浓度、皮内浓度或组织浓度相比较,以判断其与体内药理浓度的关系及其可能的实用价值,只有这样比较,才能有条件地被认为有意义。例如,一份体外研究,报告外用全反式维A酸对皮肤微血管内皮细胞增殖动力学及生长因子表达等有剂量依赖性的药理活性。该实验的学术和技术本身无可非议,但相关适应证的临床及病理资料中从来没有发现过这种疗效。如果将体外试验的有效浓度与制剂外用后可达到的皮内浓度(测定或估算)作一比较,就不难得出结论:体外试验的阳性结果来自体内达不到的实验非药理浓度。这是体外药效试验设计上最常见、最容易犯的错误。

此外还要考虑到,通常设计的实验剂量(浓度)包含着从无效应到极限反应的系列范围,同时药物的毒性也伴随剂量(浓度)的提高而递增。有毒药物如果剂量(浓度)太高,体内试验的实验动物可因而出现毒性反应,体外试验可出现细胞毒性反应;有些药物在过量下虽然不表现出毒性反应,但会出现一些特殊的、没有临床意义的药理学反应,这些剂量(浓度)问题都是在药效学试验中应当排除的。尽管这样,所得到的符合要求的数据还不一定实用并有意义。因为这仅仅是一个方面(药效)、一个模型、一个指标;是体外或是动物实验而不是人的试验。对研究非创新药,这还片面;对研究创新药,则与临床研究距离还远。所以,涉及药效试验的结果,在任何时候下结论都要慎重,尤其在论文研究中要特别注意。

容易造成剂量(浓度)设计差错的几个环节是:

  1. 剂量(浓度)设计过高,主观上希望得出阳性结果;
  2. 单剂量,没有量一效定量关系;
  3. 浓度设计偏离向S曲线的两端,测不到可能的有效、安全浓度;
  4. 剂量(浓度)设计不规则,无法作出量一效曲线或算出统计学参数;
  5. 没有求效价或没法求效价(浓度偏离、曲线中段过陡等);
  6. 样本间的相互比较放在不同剂量或不同时间之间,或随意相互比较,单纯追求数据的统计差异,用P值表示药效强弱;
  7. 剂量(浓度)设计与安全、实用不挂钩。

动物

进入生物学世纪,历来被称之为“活的试剂”的实验动物及其动物实验作为一种技术手段,发展迅速。动物实验已广泛被用于生理、病原生物、免疫、病理、药效、药代、毒理及安全性评价诸方面。

由于伦理和方法上的原因,上述生物医学研究不允许和不可能在人体上实施,只能用实验动物来替代执行。为生物医学研究而建立、能模拟人类疾病表现的动物疾病即所谓人类疾病动物模型。回顾生物医学发展史,许多重要的发现和发明,都离不开动物疾病模型,其重要性及不可替代性不言而喻。

用实验动物进行动物实验,离不开实验动物的饲养和应用的知识、技术、设施和规范的支撑;反过来,动物实验的技术、设施和规范已作为一种要求及水平的指标,列入基金申请、成果申报、论文发表,以及医疗科研机构等级考评的硬指标行列。

动物实验系统包括合格的硬件设施、有规格的动物、有资格的成员和规范化的管理。所谓合格的硬件设施,除了动物实验室选址的大环境要求外,内环境必须满足硬件技术规范规定的温度、湿度、通气、光照、气体、噪声、洁净度(生物粒子和尘埃粒子)要求。

根据实验动物的微生物控制程度,我国实验动物分为四级:

  1. 无菌动物(GF)及悉生动物(GA),又称四级动物;
  2. 无特定病原体动物(SPF),又称三级动物;
  3. 清洁级动物(CL),又称二级动物;
  4. 普通级动物(CV),又称一级动物。

其中悉生动物也称已知菌(丛)动物,是在无菌动物体内植入单种至多种的已知微生物,使动物与菌丛构成复合体。这不仅提高了无菌动物的生存能力,能引发无菌动物不能发生的迟发性超敏反应,并是研究动物与微生物、微生物与微生物相互关系,制备高纯度和高效价抗体的理想动物模型。悉生动物已被广泛地应用于医学领域中。

按微生物控制程度,实验设施亦相应分为四种类型和等级,以适应不同等级实验动物的育种和实验。即:

  1. 隔离系统(洁净度达100级),用于无菌动物及悉生动物实验;
  2. 屏障系统(洁净度达10 000级),用于无特定病原体动物实验;
  3. 半屏障系统(洁净度为100 000级),供清洁级动物实验;动物不携带人畜共患或动物传染病病原体,其洁净度及成本降低,但实验结果比开放系统好;
  4. 开放系统(环境卫生及无人畜共患病,饲料和饮水一般不消毒),限于教学示范和一般实验以及大动物实验,除大动物外,研究项目不宜应用。

选用实验动物的健康状况、年龄、性别、体重、种系、品系等指标都有技术规定,是实验研究者应当掌握和熟知的医学实验动物学基本知识,不同实验对此又都有具体要求,并应有实验及文献依据,非此不能承担和完成相应的动物实验并得到可靠的结果。由此带来的动物实验人员的上岗培训及资格认证,已列入管理常规。

从宏观的实验动物管理条例,包括监督、认证,以及有关动物遗传学、微生物学、营养学、饲养学和环境条件的国家标准的制定,到具体的实验室的标准操作规程(SOP)的制定,都表明实验动物和动物实验的“无政府”状态(诸如开放的陋室、混养混用、随意繁殖及贩购、临时工、无章程等)的年代已一去不复返。特别是新药安全性评价已率先执行GLP质量管理规范,表明了本学科与国际接轨的迫切需求。

实验动物培育有别于家畜培育,其方向是寻求群体在遗传育种(基因型)上有更大限定的品系。其目的是:

  1. 育成各种动物品种和品系,筛选突变性状,扩大遗传变异或特性差异;
  2. 育成高度遗传、性状均一的动物,使动物实验的结果具有较高的重复性和可信性。

不同的育种方式形成了不同的、各自共享一个基因库的动物群体。即:

  1. 近交系:是亲缘关系较近的个体间(多半是兄妹间)的交配繁殖,杂合型合子逐代基因分离,逐步提高个体与群体的基因纯合率;
  2. 封闭群:是非近交循环交配,使动物个体间基因趋于多样化和群体内生物学特性趋于一致;
  3. 杂交群:是指不同遗传组成的群体或个体之间,或某个特定位点基因型不同的个体之间的交配繁殖;
  4. 突变系:来自自发突变或人工诱变,形成具有原品系所不具备的遗传特征。

应用动物模型的意义在于:

  1. 用动物作为研究材料,对人类各种疾病或病理环节进行复制,以及用药物、手术进行干预,这避免了对人体的伤害,特别是外伤、感染、中毒、过敏、休克、肿瘤、放射等试验,乃至脏器摘取及处死等措施;
  2. 动物实验条件和方法有可控性,因而增强可比性,例如动物的种系、品系、性别、年龄、体重、健康状态、微生物级别、遗传背景的选择,环境的温度、湿度、光照、洁净度、空气流量的控制,以及没有社会、语言、精神等对疾病的影响,因而可在较少干扰的条件下研究单一因素的致病或治疗作用;
  3. 易获得大样本、可重复、可比较(如量一效关系、效价比)等定性、定量数据;
  4. 可连续、动态采集各类样品(包括血液、组织和整体);
  5. 动物代谢快、生命周期短,有利于研究发病慢、病程长、与遗传传代相关疾病。

动物模型的应用价值在于其模拟疾病的程度,其在不同种系中复制的通性,其实用性(包括来源、成本、复制的难易等)及是否可能满足研究需要。例如研究药效的量一效关系,要求每组动物样本数大,剂量组多,设阳性及阴性对照组及重复实验等,如果模型不易复制、代价昂贵、周期很长、产量不高或动物来源困难,则很难从基础生物医学研究的方法学成果转化为药效学研究的动物模型的。

动物模型可替代人体试验或克服后者的不足,但动物与人之间种系差异毕竟很大,所有模型都只可能在某些方面与临床适应证相似而不可能全部一致,而且动物模型本身也有不足之处(例如动物无主诉,无法测试和表达精神、情绪等许多数据),所以动物实验结论的正确性是不完全的、相对的,最后必须在临床前研究后、通过人体试验来确证。综合而论,这是一种不可或缺的互补。

以动物整体、离体及生物制品材料为基础的药效学研究,无法回避动物与人、动物与动物、动物品系间(意味着不同人种间)的共性和差异问题。新药研究的成功率如此之低,临床前研究与临床研究之间的鸿沟,体现在药效学方面,人与动物的差异是主要的、难克服的技术问题之一。如何寻找共同性、如何分析差异性及如何衔接动物与人的结果,是一门学问,理论上和实践上已有一些共识。

在选用动物种系方面,一般地说,筛选新化合物的生物活性,宜用多种实验动物来定性、定量比较药效反应,如果多种动物对同一药物的药效反应都一致,说明该药在种系间的共同性较大,其与人的共性反应可能性就大;理论和经验可提供某种动物对某种药效反应比较敏感或专一的信息,例如皮肤接触过敏、光毒性、光敏感试验宜用白化豚鼠,皮肤刺激反应宜用家兔,这种动物可称为专用动物,这是应对动物间差异大和提高指标敏感性的对策之一。

在选用动物品系方面,近交系遗传纯合程度极高,动物个体之间的差异小,实验结果可靠性高,许多近交系小鼠(如BALB/c、C57BL/6)和大鼠(如F344/N、Lou/CN等)是肿瘤、免疫、移植等研究的常用实验动物,这体现了这些种系和品系的优良个性的同时,与人的共性意义上就显得不足够。

封闭群动物遗传组成的杂合性较高,个体间差异的程度取决于其祖代来源是非近交系还是近交系,个体差异大小与群体基因库信息量关联,其共性意义比近交系大。常用的封闭群有NIH小鼠、ICR小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、Dunkin Harley豚鼠及New Zealand兔等,多用于毒理、药理、生物制品及药品检定领域,是很实用群体,基于其共性特点,在LD50测定和剂量推算等方面常选用封闭群小鼠。

突变系动物是由基因突变动物定向培育成与人类疾病相似的品系,并是人类疾病动物模型的重要来源。基因突变可发生在免疫、内分泌、心血管、神经等系统,提供了肥胖、糖尿病、肌萎缩、高血压、自身免疫性溶血和红斑狼疮相似的自身免疫性疾病的突变系动物模型,相信很多遗传相关皮肤病都可从突变动物中获得与疾病相似的动物模型。

值得一提的是杂交一代(F1)动物,这是由两个无关的近交系杂交而繁殖的第一代动物,其遗传组成均等地来自两个近交品系,属于遗传均一,并具有相同表现型的相同基因型动物。F1动物不能育种成品系,但在研究方面比近交系更适用,因为F1动物的遗传、表型决定的生物学特征比近交系动物有更高的一致性,不易受环境因素变化的影响。F1动物具有较强的生命力,具有同基因性,因而可接受不同个体乃至亲本品系的细胞、组织、器官和肿瘤的移植。很多疾病的研究模型都用F1动物,如自身免疫缺陷模型(NZB*NZW)、SLE( BALB/C*C57BL/6)等。

在实验皮肤病研究方面,实验动物的细胞、组织及其生物制品已广泛应用,突变系及F1动物的基础生物学研究亦有报道。新药临床前药代动力学及毒理学都离不开各类整体动物。但整体动物在皮肤病药的药效学研究方面还显著落后于生物学和其他药理学分支,目前动物与人类间共生的、可复制的或模拟度高的皮肤病整体疾病模型非常有限;主要原因是人与动物皮肤器官在种系发生上存在着较大的结构和功能差异,这给以皮肤为靶点的皮肤病药的药效学研究及其模型的模拟带来不少的困难和误差。

进一步加强皮肤病发病机制、病理生理和遗传学研究,加强突变动物的遗传、育种、筛选和基因工程技术的研究,加强人与不同动物间皮肤结构、功能的共性和差异的比较研究,扩大利用与人皮肤组织最接近的动物(如乳猪)做模型的用途,是当前突破瓶颈的现实可行的途径。

途径

皮肤病的药物治疗与系统疾病的药物治疗一样,涉及口服、肌内注射、静脉注射等常规给药途径。给药途径是—种手段,只为药物能有效到达靶器官。对于经皮释药制剂,它的作用靶位不主要针对皮肤,不作重点讨论。皮肤(黏膜)局部给药是皮肤病治疗的一个长处和特点,皮肤外用药是皮肤病治疗的特色手段。外用制剂直接与皮损接触,通过经皮穿透进入皮损内发挥治疗作用,对皮肤局部疾病是最适用不过的了。此外,在开放的皮损中它可保证有较高的局部浓度;抗感染药物的局部应用,常可减少及消除病灶的排毒作用;对胃肠道不吸收、不能注射的药物,局部用药对皮肤病是有利的途径。一般地说,局部治疗要比系统治疗安全得多。但是,在达到有效的前提下,系统给药或局部给药的选择,就存在对因和对症、主要和次要、全身和局部、疗效和不良反应的考虑,这是临床实践经常权衡的问题。

局部用药有一些特殊的问题,首先要强调局部用药只解决局部问题。对全身疾病的局部表现而言,局部用药可以以较少的不良反应的代价换取疾病的表面、局部、暂时的缓解,这对不能根治、需要终身给药、系统给药不良反应大的疾病(如银屑病)有时是必要的和重要的。但药物应从哪个途径给药,能否改变和增加给药途径,并不仅仅是—个药剂学的剂型和途径的问题,还涉及系统和局部给药不同的药效学、药代动力学、毒理学和作用机制问题,必须要找到疾病发病机制和药物作用机制的对接点才行。国外、内学者曾花大力气在药剂学上研制环孢素外用制剂去治疗银屑病,但始终未能成功,就是个典型的例子。

另一方面,药效或治疗作用不是简单的制剂—皮损间直接的相互作用。广泛或深在的皮肤病变,或疾病的系统病变,常需要通过循环系统将药物运送至体积不大、但面积很大的整个皮肤及其他器官,如抗感染药;或通过系统给药以针对皮肤以外潜在的病因、阻断发病环节才能发挥治疗作用,如免疫抑制剂;有些药物系统给药后皮内的分布浓度并不比局部经皮穿透达到的浓度低,有的甚至更高,治疗更有效,如某些抗真菌药;对原药无活性、需经肝脏代谢后形成活性产物才能发挥药效的药物,则只有系统给药才行,如环磷酰胺;一些药物由于其理化特性或制剂学上的原因,经皮穿透不佳,局部治疗难以奏效,如大分子药或生物制剂;而另一些药物恰恰是由于药效学的原因必需系统给药才能有针对性地发挥治疗作用,如环孢素;又如银屑病的皮损表现明显且有特征性,但主要发病环节不在局部,局部却存在潜在的“非累及皮损”病灶;这都是一些皮肤病应当系统给药的不可或缺的理由。有实验报告,补骨脂素经肛门给药后药物的血浓度和皮内浓度都较口服给药及皮肤给药高,说明皮肤病治疗的给药途径亦包括各种特殊途径。但是反过来说,要求一个药物只与病理靶点的某生物大分子结合并引起某种特定效应,这种反应又仅发生于皮肤细胞而不影响其他细胞,要求所用药物特异性、选择性皆高,这毕竟是不现实的。因此,系统途径治疗皮肤病最主要的麻烦是不良反应不可避免地比局部治疗较多或较重。

理论和实践都证明,皮肤病药物治疗中,局部和系统药物都应兼有,不能完全相互替代。重要的是权衡利弊,更多的情况下是互为主、辅,取长补短。这是皮肤病药物治疗学的一门艺术。

在应用研究和新药研制中常会遇到一些给药途径的模糊问题。例如,随意改变给药途径,系统药物用于局部治疗,理由是全身用药毒副反应大,系统用药剂量大、价格昂贵等。实际上,其可行性取决于疾病的病理生理环节(药物的靶)是否在局部,以及药物的作用是否能针对局部的靶点。又如,用非经皮释药的皮肤外用制剂企图达到经皮释药的目的,如外用非甾体抗炎药、减肥药等,其理由不外乎为了增加邻近病灶(如关节、脂肪)中的药物浓度,或为了减少胃肠道刺激和(或)首过效应,或因全身用药毒副反应大等;也有一些含有毒成分的中药的处方企图“借道”皮肤用药达到药效和毒性“分离”的目的来“摆脱”毒性。这些主观意图的“科学性”,是完全可以通过药效学实验和药代动力学血药浓度检测来裁定的。可见皮肤药理学在临床前、临床及上市后对药物研究和监测所起的作用。

总之,皮肤作为给药途径,其目的和方式有二:一是皮肤用药,其针对局部靶器官,即表皮、真皮及皮肤附属器;二是经皮释药,其针对系统靶器官,即全身各器官组织。两种皮肤给药途径的透皮、分布、代谢、转归的药代动力学过程的目的、方式和结局完全不同。以局部靶器官为目的的皮肤局部用药,其药效学、药代动力学与毒理学研究和最终评价主要针对局部靶器官——皮肤,理论上不涉及系统,但药物有可能进入系统中,后者主要作为毒理学和不良反应问题去评价;以系统靶器官为目的的经皮释药,其药效学、药代动力学、毒理学研究和最终评价与系统给药相同,但存在皮肤局部经皮穿透,透皮吸收及局部毒理问题。这是给药途径需要澄清的问题。

制剂

皮肤病系统给药制剂无特殊性,局部给药的制剂及其剂型与皮肤病治疗的关系密切,并通过多方面影响外用药的药效作用。临床上针对皮损状态或皮损部位对外用药剂型的选择对药效的影响不亚于药物本身;表面活性剂改变基质的药物分配系数从而影响药物在基质中的溶解和释放;促透剂、微乳和纳米制剂的应用可在理化方面促进药物透皮;相似生物膜结构的脂质体与皮肤脂质的相容性和亲和力能增加药物在表、真皮中的浓度和储留;脂质体的囊性结构可减少药物在真皮毛细血管网的再吸收;在不影响药物的离解度及透皮效果的前提下调整制剂基质的pH值可降低药物对皮肤黏膜的刺激性;通过稳定剂、抗氧化剂等有关配方可延长药物的稳定性,从而保证主成分含量和在有效期内药效的稳定;能影响药效或依从性的制剂色泽、气味、洗脱、延展性、黏附性等性能,亦与制剂的处方设计和工艺有关。

为了覆盖多方面、多层次的发病环节,除了局部和系统配合给药外,外用复方制剂也是皮肤病治疗的一个特点,这不仅是个长处,通常也是必需的。系统给药,每个药物可以分开并同时给予,为了治疗个体化,除了一些必需的或协定的处方外,复方并不被常规推荐;而局部用药,皮损接受药物制剂容积的能力非常有限,除了交替用药方式外,分开并同时给药的方式本身就会相互影响疗效发挥。研制好的复方制剂有可能在有限的皮损面积及制剂容积内扩大药物作用的靶点,发挥疗效的相加或协同作用,以及不良反应的减轻或抵消作用,这是利用复方的优点。皮肤病局部治疗药物有应用复方的传统,甚至酊、水、油膏等盖伦(Galen)制剂仍沿用至今,有来自传统或经验,亦有从药效学设计的处方。复方制剂同样要求有效、安全、质量可控、储运皆宜。但由于活性成分非单一,所以首先要求复方立论有据,在技术上必须弄清所含药物在药学、药效学和毒理学方面可能的相互作用,各活性成分之间及活性成分与辅料之间在溶解度、酸碱度、稳定性等方面的相容性,以及各自的最佳浓度组合等。这是外用复方新药研制的主要难点之一。

对照

在医学生物学科领域,对照试验是最重要的概念和设计之一。对照即比较,没有比较就无法对结果进行判断,也就得不出任何结论。没有对照的实验设计和论文不可能被承认及发表;但对照设计不全面、不严密、不科学和出现设计错误,却不是个别的现象。这同时也反映出一个研究者的科学素养和是否愿意得出客观和令人信服的结论的主观倾向。

在药效学研究领域,围绕着被评价的药物应设计至少两个或两个以上组别来进行对照研究。

除待测药物组外,无药对照(常称为阴性对照或空白对照)组是必不可少的,目的是找出药物以外对模型的指标发生影响的可能因素,包括被观察主体自身的变化(如模型的自限性或病情的自发缓解倾向等),以及赋形剂、基质、溶媒等药物伴随因素。所以“无药”对照组并非真正的“空白”对照组。在局部用药的药效及安全性评价试验中,还有动物皮肤反复脱毛、长时间的大面积涂药和防舔固定措施等,都会影响动物全身状况(包括舒适性、活动、食欲、进食量及体重等),此时应当增加真正的空白、阴性、不处理对照组,以判断这些附加因素是否影响了药效或毒理指标。

已知药对照(常称阳性对照)组同样重要。但是,在一些实验药效研究中,未设计阳性对照或对照药选择不当的情况并不少见。阳性对照药首先必须是作用原理已知的有效药,且应尽可能与待测药物的作用性质及与模型功能是接近的。其使用目的,一是检验模型的可靠性、灵敏性和稳定性,如果已知有效药对模型都没有药效作用或作用微弱,或反应迟钝,或重复试验波动很大,那么可能已知对照药和药效模型两者的性质与功能不一致,或其中—个自身有问题,因而整个药效试验的信度和效度也就成了疑问;其二是与待测药物相互比较,如果已知有效药物也用多剂量(浓度)求出量墩关系曲线,求出效价和效能甚至治疗指数并与待测药物进行比较,那么待测药物就能得到更多、更有价值的信息。例如,待测化合物的结构和活性如果初步确定是—个非甾体抗炎成分,其阳性对照药应首选非甾体抗炎药;如果活性不能确定或超出了环氧合酶途径范围,则对照药宜选用抑制环氧合酶和脂氧合酶双重作用的非甾体抗炎药,甚至甾体抗炎药;如果筛选脂氧合酶途径活性,就宜选用选择性脂氧合酶抗炎药作对照。

在新药评价或深入的药效分析中还涉及更多的对照设计。例如复方制剂研究,需要同时分别设其中几个主成分的单—对照组,目的在于确定药效作用来自哪个成分,该作用在复方中是增强、减弱,还是不变,以确定药效发生协同、相加、拮抗作用,还是无影响。为了确定相互关系,就必须用正交设计分别进行检测和分析,这种对照设计称析因设计。

当临床前药效和毒理分析性研究证实两药有共同的适应证,但药效原理和毒性靶点不同,临床试验亦不易找到理想的对照药作比较,则可采用待测药+对照药与对照药比较的方案,该方案仍然属于阳性对照范畴,但包含了单、复方比较及相互比较的因素在内。

如果要知道几种已知有效的药物对某个适应证哪个疗效更好,则可采用相互比较的方案,这充分利用了临床研究的综合判断特点。但这仅仅是宏观分析,只对经验治疗有好处,而且也只能得到近期有效率和不良反应发生率两个综合性数据,只能就事论事,有什么说什么,不宜下太多和太深入的结论。具体的药效靶点、作用原理、药代特点、毒理安全等问题,还得参看临床前研究的分析性数据,才能提高到药理治疗的高度。

为保证实验和临床药效研究的对照结果的可靠性,还应采取的措施包括:样本数如何能满足总体代表性,如何随机分组,是否需要配对、分层对照,如何控制实验动物组群内的差异和如何控制环境条件及影响因素以消除误差等。只有严谨的对照设计,才能使最终的结果真实可信。

以上分析不难看出,实验药理研究或新药临床前药效研究的对照设计,只要目的明确,考虑周密,还是比较可控和不难实施的。但是,新药临床药理评价或药物上市后深入的临床疗效、不良反应的比较研究,对照设计就不那么容易了。因为在临床试验中,阴性、无药、空白对照组在一般的情况下是没有的,安慰剂对照组又不能无条件随意安排,因而深埋其中的、影响疗效指标的各种非药物因素不易揭示。而阳性对照药的选择必然是作用原理清楚的上市药物,其与适应证的关系是已知的,选用的目的属于再验证,对照设计的目的主要在与被评价药物的比较,以进一步揭示后者疗效和不良反应的长短,以促进合理用药。因此,阳性对照药应尽可能与待评价药物的性质(结构类别、药效、药代、毒性、治疗作用和不良反应)相近,或多数相近以专门比较研究—个可能的变数,才能使设计不致虚设。

但是,实验或临床对照设计选用对照药有时确有困难,主要是对照药与待测药之间的可比性,以及对照药对模型或适应证的针对性方面。对此,还是耍从问题本身去解决:首先要明确对照目的;其次是所选对照药应尽可能与待测药性质相近而有可比陛;或者是尽可能在适应证或模型中找出能揭示对照药与待测药的药效或疗效的共同的、有比较意义的指标以进行比较。如果找不到性质相近的对照药,药效实验研究可利用其分析陛的特点(尤其是体外试验).在共同的作用靶点上进行比较,其比较意义也只局限在作用于某个靶点而产生的具体药效评价上;而临床试验除了从某些临床表现(如:痤疮的炎症和粉刺、银屑病的炎症和浸润)分析判断外,其综合性的疗效有时不易完全分清来自哪个环节的改善,也不易分清非共同靶点所起的作用,因此应当参考临床前研究资料或采用上述联合与单—XtHaj龆融jjI1以锯决。

例如:当研发—个口服治疗囊肿陛痤疮的新药或进一步评价—个已知的老药,可比较的药物包括异维A酸和维胺酯。对照的目的是比较有效性和(或)安全性,所选药物有共同的靶点,具备能影响囊肿性痤疮的病理生理指标的药效或疗效,所选药物的化学类别、药效和毒理性质以及临床疗效和不良反应的指标相近,因而具有可比陛。但如果选用—个已知抗生素(如米诺环素或红霉素)作对照药,并作两药的有效率和不良反应发生率比较,就显然是不妥的,因为对照的目的性、性质的可比性和指标的共同性,都不符合对照原则,这种“对照”的结论甚至在评价之前就可作出。因此,对照设计选择不当,研究本身也就失去意义。

同样,当研发一个口服治疗重型或某亚型银屑病的新药或进一步评价其中一个老药,如果药物特征与第二代口服维A酸类药物相似,则可选后者作对照和比较。如果研发的新药有更多、更好的针对适应证的新的药理活性,则可增加与新活性相匹配的模型、指标和对照药进行广泛的对照研究;如果研发或对照的药物不具备影响上皮细胞分化能力,或其药效主要针对银屑病的其他病理生理环节,如T细胞、血管内皮细胞、病理性细胞因子及炎症介质等靶点,则与第二代口服维A酸作相互比较是没有意义的。例如,以甲氨蝶呤作对照评价阿维A治疗银屑病,两药的化学类别、药效作用、药代动力学、毒理学、特殊毒理学,以及临床疗效反应、不良反应、毒性反应甚至给药途径和方案无一相同,而银屑病的病理生理环节和药物作用靶点很多,迄今还没有—个药物有完全的针对性,所有药物的作用都是部分作用于药效靶点上,其他作用于不需要并有可能产生不良反应或毒性的靶点上。因此,虽然两药都是治疗银屑病可选择的药物,都有各自治疗学的药理基础,但主要药效学靶点不同,主要毒理学靶点亦不同,除了个别定性指标相近、定量指标亦差异颇大的指标(如抑制上皮增殖)外,其中少有共性。如果从一组这样的“对照”研究中简单地通过四级疗效标准及不良反应发生率去下“比较”的结论,或在致畸、骨髓抑制及肝硬化等毒副作用相关信息揭示不全和比较不全的情况下去做“有效性”和“安全性”的比较,那么不管得出什么结论,其作用只能是误导性的。问题是这类不恰当的‘‘对照”研究在皮肤科杂志中还可见到。

20世纪七八十年代开始研制的第二代维A酸的比较研究,是—个对照研究的典型范例。阿维A(依曲替酸)的结构、药效、治疗指数、毒性、特殊毒性(致畸作用)、临床适应证与阿维A酯(依曲替酯)相似;口服生物利用度前者略高于后者(60%比40%),通过剂量的相应调整(0.2-1.0 mgkg比0.25~1.5 mg/kg),两者体内浓度接近;所以,临床疗效、不良反应基本一致。阿维A的研发目的,是在药代动力学上半衰期比阿维A酯短(50小时比80-120天);因而停药后,理论上经过7个半衰期的清洗期后的安全妊娠时间,前者显著短于后者(半个月比两年),优势明显。90年代进行的大样本、多中心、随机、双盲、对照研究再次表明:两药的临床疗效和不良反应无统计学差异。但深入的研究也同时发现,阿维A在某些患者肝内代谢后可酯化为阿维A酯,并报告饮酒后亦可能使阿维A转化为阿维A酯。因而,从安全上考虑,阿维A的说明书上仍然注明停药后应避孕两年。这类比较研究由于其目的性、严密性和科学性,其可信度和应用价值无疑是非常高的。

由此可见,对照设计的目的、要求和意义,是非常明确、严格和实用的。进行对照设计,最重要的是严谨和科学的观念。对照实验的细节考虑要周到,要排除任何主观意向性。临床及科研工作者对于对照设计,阳性和阴性结果,孰优孰劣评价的虚、实与真、伪,应有敏锐的判断力。

统计

基于生物学个体的差异性、环境条件的多变性、不可控制因素的偶然性等影响,使生物医学研究获得的数据可有较大的变异。统计学是借助数理统计方法,从有限的观察和似为偶然的数据中去揭示研究事物(或现象)的本质、整体J晴况和相互关系。因此,生命科学中的任何学科都离不开生物统计学。统计学有许多专著可以参考,这里仅是强调统计工作与实验药理及临床药理研究的相关性和重要性,以及存在的问题。

医学研究大多是观察性、实验性研究。观察陛研究如流行病学调查、疾病对生活质量影响的调查等。它要求客观、准确、真实地研究对象的特征,全过程都是客观存在的记录,没有人为的干预措施,即使是分组比较,亦不能采用随机化方法,以保持样本的特征性和可比性;实验研究如|脑床和实验药物研究,研究对象必须被随机分配到有足够样本数的各试验组,并人为地给予不同的处理,在控制其他影响因素的前提下,观察、比较不同处理因素的效应。

无论是哪一类型研究,都分为四个连贯的阶段:方案设计、调查或试验、整理和分析、讨论和结论。这又称为统计工作的四个基本步骤,因为统计学都贯穿其中,而且相当程度上影响和决定着研究质量的优劣与成败。从基金、项目、新药、论文、成果评审中常可见到下列反面的描述:研究设计不合理(包括目的依据、分组方法、样本大小、剂量选择、定量分析、对照合理性、指标可靠性、方案可行性等),资料处理粗糙,信息显示不全,分析问题不到位,统计方法使用不当,结果不可信,结论偏差、错误、无说服力等,这都与统计学设计有关,都是统计学相关陛和重要性的证明。

所有研究设计都包括两个方面:专业设计和统计设计。专业设计是保证研究结果的有用性和先进性的基础,搞好专业设计首先要明确所做研究想要解决什么问题和如何解决。对此,有关专业进展、存在问题、薄弱环节、要求条件等问题应了如指掌。药效学研究,用上面讨论过的问题和原则去进行专业设计,一般来说,即使有不周到或差错,往往是战术性的,常可纠正或局部删除的。而统计设计是保证科研结果的可靠性、可信性、可行性和运筹过程的合理性,它包含着许多影响全局和命运的决定因素,如果考虑不周,则全盘皆输。目前,执行GCP的临床药理研究的统计设计已较规范,但从皮肤科专业实验和临床研究总体来看,问题出自统计设计方面比出自专业设计方面要多。

要说现况是完全忽视了统计学,这显然不是事实;但研究者注意或偏重统计方法,淡薄统计学观念,而忽视了统计学设计,这是不争的事实。事实上,绝大多数应用数理统计方法的科研工作者对统计方法的公式和运算并不一定能掌握,但只要了解原理、正确使用即可;或者可随时查找工具书和请教统计学专家,问题也常可及时解决;而且随着计算机的普及,电脑+统计分析软件(如SPSS、SAS软件)的应用,其强大功能几乎包揽了数据整理和统计分析繁重的工作。因而,统计方法比起统计学观念,前者实际上只是一个任人使用的“工具箱”而已。因此,对结果数据的处理似乎不是难点和问题。而忽视统计学观念和违反统计学规律,在前三个阶段不掺入统计设计,造成结果似是而非,事倍功半,人力物力浪费,直至项目被否定或报废,这才是最难逆转的后果和普遍存在的弊端。

从统计学角度分析一项研究结果是否可靠,至少取决于以下三个要素:

  1. 对照组:是否设立了对照组,对照的目的是否明确和“动机”是否正确,对比条件和指标是否有可比性(均衡性)?
  2. 样本数:抽取的样本能否代表欲推论的总体?
  3. 误差:可能还存在哪些非处理因素不均衡性带来的误差,如何减少或消除误差?

对照组:对照药的正确选择、随机抽样、随机分配、采用盲法、控制非处理因素、样本数足够大等措施都是提高对照组可比陛的措施。但必须指出,在这些措施中,对照药的正确选择的主观因素最大、“正确”最难、“陷阱”也最多。除了选择不当外,还有不正当的选择。样本数:临床药理研究对人选病例制订严格的入选标准、不入选标准、剔除标准;采取随机抽样或分层随机抽样;用统计学方法估算所需样本含量n值;动物实验对笼内的动物采取按抓到的先后轮流人组等,都是提高从有限样本推算总体可靠性的常用措施。误差:通常来自三方面,即系统误差、过失误差和随机误差。

系统误差有偏向特征,引起偏差一般较大,能重复出现。例如诊断标准、疗效标准、治疗方案制订不严密,临床结果就会向某方面与真值偏离;实验仪器的指示器(重量、计数、波长、光密度等)未校正,就会给整个试验所有数据带来偏差。但只要找出原因,这种误差就能得到纠正、避免及不再出现。如修正临床评价标准,实验室的标准化管理,对仪器的定期校验,具体实验时设置内标、空白对照、扣除本底等。

过失误差在实验研究中较容易发生。在多环节操作中,诸如取样、称量、计算、稀释、进样(或给药)等环节失误,都会造成很大的、有时甚至很难发现的差错和损失。其对策是规章制度(如SOP)的保证,人员的培训和教育,通过逻辑和计算的回顾核查等。过失误差实际上是一种偶然发生的错误,可以由客观因素(如临时的电压变化或仪器故障)或一时的人为因素所造成,亦可能具有系统误差的性质,但不应把它与有统计含义的偶然误差相混淆。

随机误差(或偶然误差)一般是指排除了系统误差或过失误差后仍然存在的误差,包括由于个体差异引起的抽样误差,以及由于随机测量变异引起的随机测量误差。随机误差是各种不确定的偶然因素综合影响的结果,常不可避免和消除,反过来它会影响实验结果的准确性和精密度。但其分布是有统计规律的(如偏差的正态分布规律),通过统计学方法是可以控制的,如增大样本数、增加重复测量次数、改善测量手段和条件等。

尽管专业设计与统计设计相辅相成是研究水平和质量的关键保证,但在某些主观因素的驱动下亦可走向反面。在药效研究中,发生在对结局和命运影响最大的对照一统计环节的问题比其他环节多。例如,为了突出某待测药物的“长处”,就选择一个具有相应短处的药物作对照;为了掩盖某一待测药物对某适应证的不适应性,就选择一个更不适应的药物作对照;不考虑药物性质、作用原理和评价指标的可比性而作药物“比较”研究;用简单的临床近期有效率和不良反应发生率作为药物有效性和安全性的总评价;为了找到结论的“闪光点”,不管有无实际意义而在上下剂量组、左右时间点,甚至无直接关联的数据之间,随意作差异性比较,以求“阳性”结果;亦有用1-2个“有统计学差异”的结果对某化合物作出有发展为新药的可能的推论;有的直接用概率P值代替了有效性评估等等。这种做法的后果不但使研究得不出可靠和可信的结论,而且必然会得出错误的、能引起误导的后果。如果考虑不周和选择不当是水平问题,那么不正当的选择和用统计学方法来作掩护那就是学术做假了。这必须在研究者和评审者中引起共识,并共同把关才能解决;按有比较才能鉴别的原理,解决这些弊端的手段还得依靠统计学原理和统计学分析自身。

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