影响扩增的DNA指纹可靠性和重复性的因素有哪些?

答:由于在25℃下引物可与模板DNA非特异结合,它们产生的图谱是人为可变性和真正多态性混杂在一起的结合物,重复性很差。影响因素包括:①Mg2+浓度;②Taq聚合酶浓度和来源厂商;③DNA浓度、制备方法和二级结构;④引物的浓度、长度、G + C含量、批间差、性质和选择;⑤引物/模板比率和相互作用;⑥热循环仪型号和厂商;⑦变性时间、复性温度、延伸时间、循环次数和时间及批间温度;⑧RNA污染;⑨凝胶类型;⑩实验室间变异原因:反应体积、聚合酶类型(Taq、Tth、Thp)和用量,Mg2+、dNTPs和KCI浓度、热循环仪、琼脂糖类型和浓度,电泳的电压和移动距离,电泳期间EB存在与否,用于电泳的产物体积等。

模板DNA:在各种复性温度下DNA浓度均能影响产物图谱,包括条带数量和亮度。在低复性温度条件下,DNA在50mg~0.5μg内,ERIC-PCR产生稳定图谱,< 5ng时可见到与水空白对照管背景带相应的额外带;< 5ng时,几乎检测不到模板扩增。因此DNA浓度应准确测定和优化,荧光计与Hoechst33258染料结合测定DNA浓度优于分光光度法。在RAPD分析中,由于菌株间生长可变因素影响DNA图谱和全细胞制剂含有使模板和PCR产物降解(除非加入EDTA或放−20℃)的核酸酶,故应避免用全细胞细菌培养物,但在高复性温度下,全细胞rep-PCR已获成功。

引物:引物浓度降低,图谱带数量和亮度降低,甚至低产量或无扩增;引物浓度太高,出现错配的频率增加,产生更多的非特异扩增。引物浓度理想范围与菌种密切相关,有的细菌对变化更敏感。几条引物必须筛选,一些引物扩增效果和重复性更好,筛选产生适当复杂的图谱的引物和几条引物合理搭配联合应用可产生更详尽的和可重复图谱,并提高分辨率。为提高分析效率,每种引物和使用的DNA模板都应优化,即使是最佳条件在其他实验室或同一实验室的今后时间均不可重复。

引物/模板浓度比率:由于引物的任意特性,最佳DNA浓度因菌种不同而异。引物与各种DNA模板相互作用不同,对某一菌种较好的引物可能不适合于另一菌种,最大可能是由于潜在结合位点的丢失,为获得相同水平的扩增,需较高浓度DNA,因此DNA浓度应对固定的引物浓度滴定,每种微生物,或DNA质量和提取方法改变时,均应这样做。

DNA聚合酶:Tyler等观察到六家厂商的TaqDNA聚合酶的水空白对照管均有清楚的DNA带或片,背景图谱因厂家而异,即使同一批号不同管的Taq聚合酶,图谱也不同。这些背景图谱可能由引物和TaqDNA聚合酶的外来DNA污染引起,Hughes等对Taq聚合酶的污染DNA测序发现它们来自于几株或几种真菌类DNA提取酶的宿主细菌或克隆载体(大肠埃希菌)。设置无模板DNA的空白对照对解释背景带十分重要,但有报道认为这种背景不影响DNA样品的扩增。用不同量或不同厂家的TaqDNA聚合酶,模板DNA扩增产生的条带数量和亮度也不同,这种变异也可因移液器体积不准/酶比活性引起。降低Taq聚合酶浓度,背景从片状成清晰的带,这可解释为酶活性降低和引物扩增污染DNA减少。DelTufo和Tingey认为校正引物-模板比率,以保证DNA模板被引物饱和,并可控制这些片状物;William等报道降低Taq聚合酶/ DNA浓度可消除这些片状物;Bell和DeMarini指出这些片状物是延伸和复性任意终止产生的任意长度高分子量片段,这暗示非特异扩增产物的产生可通过改变引物/模板比率,或PCR循环次数来预防。Caetano-Anolles等报道应用一种叫Stoffel片段的聚合酶,重复性更好。DNA扩增图谱不受Taq酶的直接纯化的还是克隆的影响。但聚合酶类型(Taq、Tth、Thp)可能对结果有影响。由于不同厂商和不同管内的Taq聚合酶活性差异可影响DNA图谱,有必要将聚合酶集中在一起使用。

复性温度:在ERIC-PCR中,复性温度从25℃增加到40℃,背景带减少,55℃时背景几乎消除,这些温度变化使模板DNA图谱带数量和亮度显著变化,在55℃一些金黄色葡萄球菌株无有效扩增。

新近报道不适当的DNA制剂是不可重复的重要原因。反应体积不同,扩增产物图谱也不同。由于任意引物容易与单链RNA结合,故RNA污染也与可变性有关。Berg应用强结合寡核苷酸可降低可变性。总之,分子生物学的发展使之以成为医院感染研究的有力工具,在进行医院感染研究时,可采用多种分子流行病学方法,以相互比较并弥补各自的不足,从而为医院感染控制和预防提供有力的证据。

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