随着HER-2检测的深入开展,许多新问题日益显现。例如乳腺癌HER-2基因的异质性,17号染色体倍体数对HER-2检测结果的影响,复发灶和转移灶中是否需要再检测HER-2,新辅助化疗是否影响HER-2的检测结果,在导管原位癌中进行HER-2检测有意义吗?HER-2检测有无“金标准”等。
HER-2基因的异质性
2009年4月,乳腺专科病理医师、分子病理学专家、细胞遗传学家、IHC专家和具有丰富HER-2FISH检测经验的专家共同参加撰写了《乳腺癌HER-2检测的基因异质性——专家组总结和指南》。该总结和指南对HER-2基因异质性的定义、确定有无基因异质性的方法等进行了说明。
1.HER-2基因异质性的定义:广义上讲,只要肿瘤细胞中HER-2基因的扩增存在某种程度的差异性,即可认为乳腺癌存在HER-2基因扩增的异质性。狭义上讲,浸润性乳腺癌HER-2在FISH检测中,每个肿瘤细胞均能计数获得一个HER-2信号数/CEP17信号数的比值(即单细胞HER-2/CEP17比值)。如果单细胞HER-2/CEP17比值>2.2的肿瘤细胞比例达到计数肿瘤细胞量的5%~50%,则该肿瘤被视为出现HER-2基因异质性。对于单探针的HER-2 FISH检测,如果单细胞HER-2信号数>6的肿瘤细胞占计数肿瘤细胞量的5%~50%,也视为存在基因异质性。该指南提出,如果>50%的肿瘤细胞的HER-2/CEP17比值>2.2,则此肿瘤应被视为基因扩增。
2.HER-2基因异质性的检测:为了准确判断乳腺癌中是否存在HER-2的基因异质性,FISH结果判断时需结合HE染色切片,选择2~4个浸润性癌区域进行HER-2/CEP17计数。计数前应在荧光显微镜下扫描整张切片,观察是否存在HER-2基因异质性,以选择需要计数的区域。计数的肿瘤细胞不能重叠,具有清楚的核膜,至少存在一个橘红色和绿色信号。当存在HER-2基因异质性时,FISH报告中应注明HER-2扩增细胞所占比例,是散在分布或簇状分布;如果HER-2扩增细胞呈簇状分布,应注明该区域平均每个细胞核内HER-2和CEP17信号数以及HER-2/CEP17比值。如穿刺标本中存在基因异质性,则FISH报告中需注明该结果不能代表肿瘤的整体,建议如有手术切除标本可再行HER-2的FISH检测。虽然HER-2基因异质性的临床意义目前仍不明确,但它可导致IHC与FISH检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致,从而影响抗HER-2靶向治疗的选择。
17号染色体倍体数对HER-2检测结果的影响
部分乳腺癌存在17号染色体不是正常的二倍体,而是多倍体或单体。有关17号染色体多倍体的定义尚不统一。多数文献认为每个细胞CEP17的信号数≥3为多倍体,也有标准判定每个细胞CEP17信号数≥2.25或2.2为17号染色体多倍体。每个细胞CEP17信号数≤1.25属于17号染色体单体。
乳腺癌中17号染色体多倍体的发生率为13%~46%,既可以单独存在,也可以发生于HER-2扩增的病例。17号染色体多倍体可引起乳腺癌HER-2基因拷贝数的增多,从而导致HER-2蛋白表达增强,可能是IHC 2+或3+但FISH无扩增或低扩增的原因。有研究显示,所有FISH检测结果为HER-2扩增不确定的乳腺癌都存在17号染色体多倍体,但其HER-2蛋白表达不会出现IHC3+。存在HER-2扩增的乳腺癌中,17号染色体多倍体对检测不会出现明显干扰。但在HER-2无扩增的乳腺癌中,由于其可导致HER-2基因拷贝数的增加可能会影响检测结果,此时若仅计数HER-2基因拷贝数会造成结果不准确,而HER-2/CEP17比值更能准确反映HER-2扩增状态。
从临床病理学特征上分析,存在HER-2扩增的乳腺癌常表现为高级别、ER/PR不表达及预后不良等,而17号染色体多倍体的病例更接近于HER-2无扩增的乳腺癌,与肿瘤级别、ER/PR状态及预后没有明显关系。但是,也有学者认为整条17号染色体的多倍体罕见,17号染色体着丝粒的多倍体并不能代表整条17号染色体多倍体。当用17号染色体着丝粒附近的其他基因如p53、SMS或RARA作为参考基因时,有43.9%(58/132)乳腺癌HER-2状态的评估结果由无扩增变为扩增,提示17号染色体多倍体对HER-2检测的影响值得进一步研究。17号染色体单体可能是IHC阴性或2+但FISH存在扩增的原因。因此,推荐在HER-2的FISH检测结果中报告17号染色体倍体数。
乳腺癌转移灶和复发灶的HER-2状态与原发灶是否一致
Houssami等对26项研究中的2520例乳腺癌患者进行了原发灶与转移灶中HER-2的比较分析,结果显示,原发灶和转移灶HER-2不一致率为5.5%,HER-2阴性变成阳性与HER-2阳性变成阴性的概率相似。进一步分析显示,远处转移与原发病灶中的不一致率明显高于淋巴结转移与原发灶中的不一致率,分别为9.6%和4.2%。
造成HER-2表达差异的原因可能主要是肿瘤自身性质发生了改变,如疾病进展过程中的克隆选择、肿瘤异质性等,而非检测方法或判读上的差异。由于文献报道中多采用回顾性分析,因此是同时检测原发灶和转移灶的HER-2基因状态。而实际工作中原发灶与转移灶多在不同时间检测,如果原发灶的发生时间较早,则可能在检测过程及结果判读中存在诸多因素影响HER-2检测的准确性。因此,在可能的情况下,建议在转移性或复发性肿瘤中重复检测HER-2状态。对于复发病灶,HER-2重复检测对于确定为真正复发(true recurrence)还是第二原发(second primary)也有所帮助。
新辅助化疗是否影响HER-2的检测结果
新辅助化疗是乳腺癌整体治疗的一部分,目的在于术前对某些较晚期的乳腺癌病例采用化疗,使肿瘤体积缩小,术前分期降低,便于手术治疗,同时也可清除体内的微小转移灶。通过新辅助化疗可直观了解肿瘤对所给予的化疗药物是否敏感,从而为进一步选择合适的治疗方法及判断患者预后提供依据。那么,新辅助化疗前后HER-2的检测结果是否会发生变化呢?目前研究报道并不一致。Arens等通过FISH及RT-PCR方法比较25例接受新辅助化疗患者术前活检以及手术切除标本中的HER-2基因扩增状态,结果提示HER-2状态在新辅助化疗前后保持相对稳定。但最近德国学者研究发现,接受新辅助化疗后有13%的乳腺癌患者HER-2蛋白表达由2+或3+变成阴性,2%的乳腺癌患者HER-2由阴性变成阳性。新辅助化疗后HER-2状态发生改变的原因,推测可能是肿瘤细胞在治疗后发生遗传学上的改变,如基因表达的获得或缺失、染色体不稳定性等。此外,新辅助治疗前检测HER-2多采用乳腺穿刺组织,取材有限,当存在HER-2基因扩增异质性时也会导致与新辅助治疗后手术标本检测结果的差异。因此,推荐新辅助治疗后的手术标本应再次进行HER-2检测,以准确了解HER-2基因扩增状态。
导管原位癌的HER-2检测
依据《乳腺癌HER-2检测指南(2009年版)》,乳腺癌HER-2的评价应仅在浸润成分中进行,其原因是HER-2在32%~55%的导管原位癌中过表达,在60%~70%的高级别导管原位癌中过表达。
近来的研究结果发现,导管原位癌中HER-2阳性与浸润灶的存在显著相关,35.8%HER-2阳性的导管原位癌中伴有浸润现象,而HER-2阴性的病例中仅12.2%存在浸润,因此HER-2的IHC染色一定程度上能提示导管原位癌病例伴有浸润的概率。另外,在22例伴有浸润的导管原位癌中,有17例的导管原位癌成分与浸润性癌成分HER-2表达一致(6例HER-2均为阴性,11例HER-2均为阳性),还有5例HER-2表达不一致的病例均为导管原位癌成分HER-2阳性、浸润性癌成分HER-2阴性,提示并非所有的浸润性癌都具有与原位癌一致的HER-2状态。此外,低级别导管原位癌往往激素受体阳性,HER-2阴性,Ki-67增殖指数较低,这种原位癌可能需要很长的时间才发展为低级别浸润性癌,也可能不再进一步发展。与此相反,高级别导管原位癌往往激素受体阴性,HER-2阳性,Ki-67增殖指数较高,可能会在短期内进展成高级别浸润性癌。因此,导管原位癌中不同的HER-2状态预示着其转归和预后不同。
尽管HER-2检测在导管原位癌中具有一定意义,但与针对HER-2的靶向治疗无关。在目前的指南中也不要求在导管原位癌中检测HER-2,且强调在病理报告中需要标明浸润性癌的HER-2状态。
HER-2检测的金标准
乳腺癌的HER-2检测方法包括IHC和FISH,那么哪种检测结果是金标准?两者检测结果显著相关,但并非完全一致。Cuadros等的文献复习显示,HER-2的IHC 3+病例中FISH阳性率为83.5%,HER-2的IHC 1+和0病例中FISH阳性率为9.3%。IHC和FISH不一致的主要原因包括:①检测或判断环节中存在问题;②两种检测方法的判断标准不一致;③HER-2基因扩增的异质性(包括不同标本类型、不同蜡块);④17号染色体的多倍体或单体等。
对于乳腺癌HER-2的检测方法IHC与FISH,孰优孰劣,一直存在争议。IHC方法简单快速,大多数病理实验室均可开展。免疫组化切片中可以同时观察组织学形态,其切片可长期保存,且可反复评估。尤其是全自动免疫组化技术的开展,使该项技术的稳定性和可重复性有了显著提高。IHC方法的缺点是检测结果易受检测中各种因素的影响而产生偏倚。FISH法检测结果较免疫组化更定量化,稳定性好,也可自动化操作。但是,检测价格较免疫组化昂贵,信号强度随时间衰减,较难鉴定乳腺癌微小浸润灶,不能同时观察细胞形态,病理医师及技术员的经验和接受的培训也相对较少。近年来的研究显示,乳腺癌FISH法的检测结果准确,且可重复性好,受组织固定等因素影响较小,与曲妥珠单抗的治疗反应相关性好。这说明两种检测方法各有优缺点。然而,无论采用何种检测方法,只有严格遵循各环节的标准操作程序,并保证内部和外部质量控制,才能最终提供可信赖的检测结果。
HER-2检测前、检测中、检测后等过程中存在诸多影响因素,任何一个环节出现差错都可能影响最终结果,规范化的操作程序和标准化的结果判读,能提高HER-2检测的可靠性和可重复性。同时应做好标准化操作程序、室内质量控制、室间质量控制及人员培训等工作,并重视多学科合作的重要性,加强临床与病理的交流沟通,有助于对HER-2检测结果的正确诠释,以及对曲妥珠单抗等药物治疗疗效的客观评价。
(叶丰 黄会粉 步宏)